关键词：苯丙酮尿症；氨基酸；气相色谱质谱联用；筛查；衍生化
中国分类号 0658,Q51 文献标识码 A 文章编号 0251—0790(2001)Ol一0052—03
苯丙酮尿症(PKU)的发病原因是患者苯丙氨酸羟化酶的缺陷，从而导致体内苯丙氨酸 (Phe)不能正常代谢为酪氨酸(Tyr)，前者在体内大量堆积并氧化为有害的苯丙酮酸．PKU是 目前筛查范围最广的氨基酸代谢遗传疾病，全世界每年约有一千万婴儿接受PKU筛查 ；在中国 PKU也是卫生部要求重点筛查的病种．目前常规筛查方法是细菌抑制法(BIA)，它的特点是费用低、速度慢、容易产生假阳性；Chace等报道了 MS—MS方法筛查新生儿PKU．曲峻等发展了Chaee的方法，采用 HPLC与MS—MS联用方法(LC—MS—MS)筛查新生儿PKU，利用 HPLC富集，MS—MS作为HPLC的检测器定量血样中的苯丙氨酸和酪氨酸．MS—MS和 LC—MS—MS方法速度快，准确性好，由于是通过测定Phe与Tyr的比值来筛查 PKU，克服了假阳性的产生．但是 LC—MS—MS和 MS—MS价格都很昂贵，不适合国内普及推广．本文将血样 中的Phe与Tyr进行化学修饰后，采用化学电离源选择离子的方式用气相色谱质谱 (Gaschromatography—chemical ionization—mass spectrograph selective ion measurement 简称 GC—CI—MS—SIM)进行分析，测定Phe和Tyr相应衍生物 的准分子离子峰面积，用外标法计算出血样中的Phe与Tyr摩尔浓度，与MS—MS、LC—MS—MS一样取得同样满意的效果．由于GC—MS价格较低，适合国内普及推广。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂 甲醇(分析纯)，0.1% HC1-甲醇(自制)，苯丙氨酸标准品(第二军医大学服务公司)，酪氨酸标准品(新兴医药保健公司)，3.0mol/L HCI-正丁醇(自制)，三氟醋酸酐，血纸样(上海新华医院提供)。氮气吹于装置(自制)，高速离心机，烘箱，GC-MS(美国Finnigan公司)
1.2 实验方法 色谱条件：HP-1石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25um)；柱温150℃～250℃(保持2min)；升温速度15℃/min；汽化室温度280C；He载气，流量1.0mL/min.
质谱条件：正离子化学源；CH4反应气；离子室温度150℃；倍增器电压550V；选择离子m/z 318，430
样品处理：将采集血样吸附在滤纸上，挥干}用打孔器在滤纸血斑处打下-直径为8.0mm圆形片(全血约合20μL)，放人1.5PV管中，加入200μL甲醇萃取剂(含0.1%HCI)，振荡3Omin，离心，吸取100μL上清液注入2.0mL安瓿管，氮气吹干；加入100μL HCl-正丁醇，封管，在120℃烘箱内酯化60min，开管后加入50μL CH2Cl2，氮气吹于；加入100μL乙酸乙酯和100μL三氟醋酸酐，封管，在烘箱120℃酰化30min，反应液用氮气吹于，加100μL甲醇溶解，取1μL作GC-CI-MS-SIM分析.
定量分析：精确配制0.92μg/mL，2.3μg/mL，4.6μg/mL，23μg/mL，46μg/mL苯丙氨酸、酪氨酸的标准溶液，分别标为P1～P5和T1～T5。取下标相同的苯丙氨酸标准溶液和酪氨酸的标准溶液各100μL加入同一个安瓿管，然后按上述样品处理方法操作。取1μL样品.用GC-CI-MS-SIM测定Phe和Tyr衍生物的准分子离子M+1峰的峰面积，根据峰面积作标准曲线。血纸样按样品处理方法处理，以上述相同条件进行GC-CI-MS-SIM分析，并根据各自标准曲线计算出血样中Phe和Tyr的浓度。
2 结果与讨论
2.1 方法原理用正丁醇在烘箱内120℃条件下使苯丙氨酸、酪氨酸丁脂化，再与三氟醋酸酐酰化，分别生成化合物：alanine，3-phenyl-N(trifluoroacety1)一，butylester和L-tyrosine，N(trifluoroacety1)一，butylester，trifl.这两种化合物具有较好的挥发性，可以用GC-MS进行定量分析。上述二步反应迅速、完全，符合定量分析的要求.因此通过测定苯丙氨酸、酪氨酸的上述衍生物峰面积来定量其浓度。采用CH4作为反应气、正离子化学电离源使上述衍生物产生强度很大的准分子离子峰，提高GC-MS的灵敏度.由于血样中有很多干扰峰影响Phe和Tyr峰面积的准确测定，选用Phe和Tyr衍生物强度很大的准分子离子（m/z 318，m/z 430)作为特征离子进行扫描，可以提高灵敏度且很好地避免了干扰峰的影响，确保定量分析的准确性.图l为Phe和Tyr衍生物的选择离子色谱图，两种化合物的保留时间分别为5.984min和6.768min。
2.2 标准曲线 将定量离子色谱峰面积 A对浓度 c作线性回归 ，得线性方程：
Aphe= 2235lc - 1248 r2=0.999
ATyr = 34885c + 2230 r2=0.997
可见两者在检测范围内有很好的线性关系。
2.3 加样 回收率和精密度 Phe和 Tyr加入 0.092μg，0.46μg，2.3μg的加样回收率分别为 95%， 98% ，102% ；98% ，101% ，96% . Phe各浓度的精密度为 3.1% ，2.4% ，1.5 %(=4)，Tyr为2.6% ， 1.3% ，2.2% (n=4).检测限Phe，Tyr都 为 0.01μg。正常新生儿血液氨基酸浓度下，Phe和Tyr的信噪比在103数量级以上.
2.4 讨 论 常规筛查 PKU的方法细菌抑制法(BIA)是通过测定血样中 Phe的浓度来诊断 PKU，当 血液中 Phe的摩尔浓度大于 258μmol/L时，可以诊断为 PKU[3]。但是早熟婴儿及成年 人血液的 Phe 浓度很大，因此用上述方法容易产生假阳性.而用 Phe与 Tyr摩尔浓度之比作为诊断依据可以消除假 阳性 ，Phe与 Tyr摩尔浓度比大于2.5可以确诊为 PKUE[2,3,5]。
表 1为GC-CI-MS-SIM测定血样中Phe，Tyr的结果．根据它们的比值确诊4#、5#患有PKU。其中6#和7#为成年人血样，可见成年人血液中Phe的浓度比正常新生儿血液中的Phe大得多，但浓度比却小于1。用BIA方法诊断6#和7#为PKU，结果产生假阳性。
本方法与BIA相比，可以消除假阳性，提高诊断的准确性。与MS-MS，LC-MS-MS相比同样有分析速度快、稳定性好等优点。同时由于采用化学电离源和选择离子的方法，因而具有较高分析灵敏度，更重要的是GC-MS与MS-MS、LC-MS-MS相比价格低得多，适合我国普及推广。因此，GC-CI-MS-SIM方法是一种适合我国大规模筛查PKU的较好方法。
参 考 文 献
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