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专家讲坛 | 袁超(第5期):外标及定量方法总结
发布日期:2019-04-09   来源:临床质谱网   浏览数:159

编者导语:非常荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者。承接上期,本期袁老师为大家带来外标与定量法总结的精彩解读。


作者简介:现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。


第七节 外标及定量方法总结


临床质谱这一系列文章是我两年前的夏天写的。后来因为种种原因,一直没有再续。最近这些文章被《临床质谱检测》的小编发现了,转载了他们的推文里。在此我要感谢他的欣赏和读者的捧场。希望大家有什么反馈和要求,都可以写在留言里。


在跟这位小编接触的过程中,我们做了一些学术性的探讨,由此对以前的文章也做了些调整和修改。我们最近讨论的一个话题是外标法。小编提到了一些我忽略的知识点,所以我把外标单独写了一节,另外把各种定量的方法总结一下。再次重申,都是我的一家之言,仅供大家做参考。你们如果喜欢如下的内容,那要感谢这位小编约稿的热情和对我的盲点的提醒。


从科技发展的历史来看,内标要比外标晚。所以应该是先讨论外标,后讨论内标。但因为是临床质谱的文章,外标这个概念基本不涉及,所以在以前的章节里,一直也没有提到外标。那么我们现在就要沿着时间的长河逆流而上,回到还没有液质联用的年代,看一看外标的兴起和衰落,以及残存到现在的一些独特用处。


什么是外标?外标就是独立于病人样品之外的标准品。而内标是加在病人样品里面的标准品。在绝大多数的临床检测方法里,比如光吸收和免疫法,是不用内标的,所以外标就是标准品,也没有必要做出外标和内标的区分。就好像时区这个概念,在中美之间有不同的使用习惯。美国有好几个时区,每次开电话会议都要确定到底是东部时间还是西部时间。中国就一个时区,没有必要提醒大家开会是北京时间,说的话就显得有点儿画蛇添足。


外标与内标的并存和区别使用是在色谱法里最先开始的。色谱的外标其实也是标准品。色谱方法可以加内标,也可以不加内标。如果不加内标,那就是纯外标的方法,这个才是我们溯流而上要寻找的老祖宗。在纯外标的色谱法里,外标的浓度从低到高都有,上样以后经过色谱分离,然后流到检测池,产生一个色谱峰。色谱峰的峰高或峰面积与浓度成正比,画一条直线就是标准曲线,由此可以去算出病人样品的浓度(图一)。早期算峰面积的方法很原始:把色谱峰打印在纸上,用剪刀把峰剪下来,然后放到天平上称,用纸的重量代表峰面积。当我们感慨当年编程用手工在纸带上打孔是多原始时,色谱其实也经历了类似的翻天覆地的变化。

图一 外标法定量示意图

色谱方法进化过程中的一个重要里程碑就是内标的引入。色谱是一条河,弯来弯曲有变数。内标可以模拟被测物的行为,让定量更加准确。所以在色谱法里,内标的用法和原理是和质谱法一样的(见上一节)。也是用被测物和内标的比值来定量(图二)。但区别在内标的理化性质。色谱的内标必须要能和被测物在保留时间上分开。所以色谱的内标不可能是稳定同位素标记的,而是一个类似物,比如加了个甲基或乙酰基的类似物。这样在样品前处理时,基本能代表被测物的行为,在色谱洗脱时又能和被测物分开。色谱的内标一定不能是内源性的。如果病人的样品里有内标这种化合物,那方法就不稳定了。有时候好不容易选了个不错的内标,跟被测物类似,而且体内也没有,但没过几年,内标被FDA批准了,变成药了,这下有些人的血液里带这个内标了,方法就需要重建了。

图二 内标法定量示意图

正是因为色谱法里引进了内标这个概念,才把以前的标准品硬生生的的给改成了外标。就好像反向柱的出现硬生生的把以前的色谱柱改成了正向柱。在反向柱出现以前,色谱柱都是正向的;在内标出现以前,外标是叫标准品的。


液质联用又是一个大的技术飞跃。它结合了液相色谱的强大分离、纯化功能和质谱的无可比拟的灵敏度、特异性。软电离让这两个技术无缝对接,优势倍增,得诺贝尔奖是实至名归。在液质联用的方法里,同位素内标的使用相当于如虎添翼,让质谱法一跃成为临床检验里的金标准,定量的标杆。讲到同位素内标,我们才又顺着历史的长河回到了当下,回到了大家都熟悉的定量方法。但是内标的讨论并没有完全结束。


有些复杂的方法,被测的物质太多,比如新生儿筛查(简称新筛),我们不可能给每一个被测物找到一个对应的内标。这个时候一些理化性质相似的被测物就要共享一个内标了,或者共享一条标准曲线了。这时候的定量就不是非常准确了。但新筛的正常范围和不正常范围区别很大,定量上有些偏差不影响临床的应用。


新筛要是给每一个被测物做一条标准曲线的话,这个难度非常大。很多标准品是买不到的。买到了,稳定性、准确的称量都是个问题。所以新筛用了个不得已的简单定量方法:被测物浓度等于被测物的峰面积除以内标的峰面积乘以内标的浓度。这里面有一个假设:内标的离子化程度和质谱信号强弱是和被测物相当的。注意是相当,不是相等。只要是相当的,那么用此方法建立的正常值范围就是可靠的。这样的半定量方法在新筛上用得很普及,对临床的贡献是有目共睹的。


像新筛这样完全用内标做定量的方法对内标的稳定性有很高要求。如果时间长了内标有降解,那么做出来的结果就会偏高,就会出现假阳性,会有很不好的后果。如果因为过了保质期要经常去买内标,价钱贵不说,不同批次间的差别也会影响方法的稳定性。内标买来以后,怎样保持、延长它的稳定性,这里面有很多窍门。经过跟小编商量,考虑到可能有的商业利益冲突,决定还是不在这里透漏的为好。


在此总结一下如上讨论过的定量方法。即用外标,又用内标的方法定量最准确,在色谱和质谱里也最常见。稳定同位素的内标只能用在质谱里,色谱里的内标是类似物。类似物内标也可以用在质谱方法里(比如几个被测物共享一个内标,或共享一条标准曲线的情况),但这种定量不能称为全定量,但又比下面的半定量要好。所以我给它起了个名字叫,叫四分之三定量(共享一条标准曲线。注意,只有个别厂家的软件允许共享标准曲线)和八分之七定量(共享一个内标,但是有各自的标准曲线。大家可以自己在实验室试一下,把被测物的内标在软件里互换一下,比如维生素D3的内标换给维生素D2用。标准曲线和质控的结果都会差一些)。只用外标,不用内标的质谱方法是老方法,已经被历史所淘汰;只用外标,不用内标的色谱方法还存在,它们被历史抛弃只是时间问题。只用内标,不用外标的质谱定量方法只是用在个别的项目中,尤其是新筛的项目。在其它领域的应用还在探索过程中。对这种定量方法的普遍了解、认可、和接受还没有到来。这样的方法因为没有标准曲线,所以不是真正意义上的定量方法,只能叫半定量。这样的方法在不同实验室之间是没有办法比较定量的,只能比较定性的结果。


这一节的技术讨论到此为止,最后跟大家分享一个我自己亲历的小故事。小时候我就是个文学青年,喜欢读小说,也喜欢写点儿东西。看故事看到感人的地方,会情不自禁,泪如雨下。成年以后,心理成熟的多了,也就不那么触景生情了。后来接触了医疗服务这一行,见多了生死,解剖过尸体,心也就更硬了。但那天不经意的看到一份儿病历,里面夹了一封信,一行一行读下来,不禁潸然泪下。这是一名护士写的临终记录,记录了一名新生儿的最后时光。专业的白描叙事里,让人如临其境,好像能看见撒在病床上的阳光,能听见静脉输液的滴答声,不禁感叹生命的脆弱和人性的温暖。那时自己初为人父,更能感同身受,理解做父母丧子的切肤之痛。于伤心处,不忍卒读,掩卷几次,方才读完。我无法重复护士的原话,法律不允许,道德也不允许。新生儿到生命的最后也没有个名字,就叫baby girl。就是这个baby girl和她的家人,对我们的新筛方法做出了巨大的、无可比拟的贡献,让我们可以一直有一个可靠的、稳定的方法去造福其他病人。我要深深感谢这个baby girl, 也深深感谢她的家人。


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