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专家讲坛 | 袁超(第6期):离子抑制
发布日期:2019-04-16   来源:临床质谱网   浏览数:222

编者导语:非常荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者。承接上期,本期袁老师为大家带来离子抑制的精彩解读。


作者简介:现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。



第八节 离子抑制



要想理解质谱里的基质效应,必须先了解离子抑制。这两个概念有很大的关联性,但绝对不是同一回事。就好像收入和利润的关系,都跟挣钱有关,但差别还是相当显著的。


同样量的内标加在不同的样品里,最后出来的内标的丰度不尽相同,这里面有很多原因。隐藏在其中的一个原因就是离子抑制。要想理解离子抑制,咱们先得把其它的原因去除掉。


第一个原因就是LCMS本身的变数。即便是同一个样品,比如一个标准品,测几遍,每遍的结果都不会完全相同。那同一个样品测n遍,怎样的CV才算可以接受呢?这个没有统一的规定,当然越小越好。有些检测项目的最大允许误差(total allowable error,简称TEa)是公布了的,一般在20% 到30%之间。所以同一个样品由不同的人在不同的日子里测n遍,一般小于20%的CV是可以接受的。但这个20%包括了人与人,天与天之间的差别。连续测同一个样品的CV要远远小于20%才行。我自己的标准是3-6%。3%是优秀,6%是及格。这就好像我总共有20块钱来吃午饭,我可以拿出来3到6块花在路费上,剩下的钱用来买饭。要是花了15块路费,这午餐就很紧张了,很容易超支。这样的方法就不要往下做了,需要反炉重新优化。


这个3-6%是指浓度,或者被测物和内标的比值的CV。如果只算内标峰面积的CV,我个人认为应该在6-10%之间,6%是优秀,10%是及格。根据是什么呢?没有非常科学的根据,自己的经验得来的。如果非要找根据,那就是sigma了。20%除以6%是三,20%除以3%是六;三个sigma是及格,六个sigma是优秀。sigma的算法和意义以后再讨论。内标的CV一般会比【被测物和内标的比值】的CV大一些,翻个一番,到6%~10%的范围,是正常的。这也是我们为什么用内标的初衷,就是用来消减被测物信号的CV。


同一个样品测n遍,内标的CV在10%以内;那同样的量的内标放在不同的病人样品里,怎样的CV算合适呢?没有统一的标准,你个人认为把10%再翻一番,20%。这个值还是越小越好。能做到10%以内就算好方法了,这样的方法上了临床以后麻烦也会少。需要注意一点的是要让仪器预热好了再测,要不然的话,内标变化过大有可能是仪器还没有稳定造成的。尿液里的成分变化太大,很难达到小于20%的要求,可以放宽一些,甚至到50%。这样做是合适的,因为尿里的浓度已经跟血液浓度没有严格的相关性了,定性大于定量,除非是24小时尿。如果对尿液浓度的测量真的要求很高,那最好还是把CV做到20%以内。如果被测物浓度够高或者质谱仪够灵敏,那么一个简单的办法就是稀释。任何的样品,不管是血样还是尿样,稀释100倍以后,肯定没有离子抑制了,内标的CV也会很稳定。


把内标的CV尽量做的小的好处是什么呢?那就是能更好得看到其它的东西。打一个比方,坐在摇晃的车里写字,车摇晃的厉害了,写的什么字就看不出来了。要想看清写的字,就要把车的摇晃度给降下来。车开得越稳定,越能写更小的字。内标的CV就像车的摇晃度,越小才能看见手的细微动作。


CV降下来以后我们要看什么呢?看outlier,看内标太高或太低的点。如果绝大部分病人的内标都在平均值的上下10%以内,那突然有一个点在20%,那这个点就是outlier。如果内标的CV在40%,那只有60%以外的点才能算outlier,就好像坐在走山路的车里,颠簸得太厉害,只能写大字了,只能看到很离谱的outlier了。


某个病人样品里的内标太高或太低,成了与众不同的outlier,这是个警告,这里面有很多信息,有很多原因。内标太高或太低时,测得的病人结果有可能是不准的。直接把这样的结果送出去是可能会对临床产生负面影响的。内标outlier的成因可以大致分为两类,一类是不可重复的,另一类是可重复的。不可重复的有很多原因。第一,内标加的体积不对,少了或多了。气泡会导致少,tip外面多挂一滴会导致高。不小心加了两次内标也会导致高。第二,样品的体积不对。加少了会导致内标高,加多了会导致内标少。第三,进样量不对。加样时要是混进了个大气泡,会导致内标减少。这个有时可以从液相的压力曲线上看的出来。第四,液相什么地方漏了,样品有丢失。一般这种情况下,后面的所有的样品的内标都低。以上这几种情况都是不可重复的。一个方法既然已经上临床了,那表现肯定是不错的,在大部分的情况下,是不应该出现上述的情况的。如果真的出现了,那重复一次还会同样发生的几率是小之又小。如果真是体积加错了,是能检测出来的,有时肉眼都能看得出。如果再测一次,内标是好的,病人结果跟第一次一样,那就有可能是LC进样时有了气泡或者哪里漏了。如果第二次的结果跟第一次不一样,那就再测一次,看能不能重复第二次的结果。如果可以,那就说明第一次有可能是体积加错了。总之,这几种原因导致的内标升高或降低是不可重复的,再做一次可能就正常了。


如果再做一次,甚至再做两三次,内标总是偏高或偏低呢?这就是样品本身引起的了,是可以重复的。这里面又分为两个原因,一个是离子抑制,也就是本节的主题,另外一个是干扰物。离子抑制也是由干扰物引起的,但这个干扰物是看不见的,峰的形状没有异常,只是峰面积小了。能看得见的"干扰物"是会把峰型给搞糟的,多了个峰肩或有拖尾。看的见的干扰物以后再说,这里只讲看不见的干扰物,也就是离子抑制。在这种情形下,病人的血液里有一种物质,可以把内标的信号给抑制掉,这就是离子抑制。
离子抑制一般发生在离子化这一步。离子化是链接色谱和质谱的关键步骤。离子化其实是和气化几乎同时发生的。这个过程就像一只水枪包括在一个通了电的吹风机里。被检测物和内标从水枪里出来,周围夹裹着吹风机里吹出的热气,附近还有高压电。最后的结果是热气把液体蒸发了,高压电把分子给离子化了。只有这样,赤裸的带电离子才能飞进质谱,被检测到。


如果病人的样品里有这么一种物质,比如是一种药物或药物的代谢物,它正好和被检测物同时从那液相里出来,同时被离子化。如果这种物质的浓度够高,那么它就会和被检测物以及内标去争抢离子。争抢的结果就是被检测物和内标的离子化不完全,产生的离子少了,信号自然就弱了,就变成outlier了。而且这个outlier是可以重复的,因为那个药品存在在样品里,测多少遍都是那个时候出来,跟被测物抢离子。


离子抑制怎样确避免呢?样品稀释一下就可以做到。样品稀释以后,一块儿出来的其它物质就被稀释掉了,但是内标加的还是一样多。敌人少了,内标的浓度没变,争抢离子的战斗就会偏向内标这一方。最后的结果就是内标的峰会升高(但不会高到跟平均值一样的水平,因为敌人只是减少了,并没有消失),但是被测物和内标的比值不变。也就是测得的结果在考虑到稀释的倍数以后是不变的。如果稀释后是这样的情形,内标向平均值靠拢,而且测得的结果不变,那内标减少的原因就是离子抑制。测得病人的结果是可以出具的。


在用稀释来解决离子抑制的过程中,有个很有趣的现象,每次都能重复出现,那就是稀释一倍以后的内标会好一些,但总达不到预期的水平。比如不稀释的话,内标被抑制了50%,那稀释一倍以后应该是被抑制25%。但实际操作中往往是在30%左右,靠近黄金分割的那个比例,0.618。它离不稀释的内标值的距离近一些,是4;离均值远一些,是6。这里面肯定有什么规律在里面,但是我还没有找到令人信服的科学依据。我只能用一个生活中的例子来大概解释一下:没有离子抑制的样品干净,像牛奶;有离子抑制的样品脏,像咖啡。把牛奶咖啡混在一起,颜色居中,但更偏向咖啡一些。就好像把一滴牛奶滴到咖啡里,咖啡还是咖啡的颜色;把一滴咖啡滴到牛奶里,牛奶就会有咖啡色。


在此总结一下本节的内容:

1. 病人样品里的某种物质在离子化时跟被测物竞争,导致信号降低,造成离子抑制。

2. 离子抑制是可重复的,与样品制备无关。
3. 离子抑制是可以用稀释法来消除的。
4. 离子抑制只有在特殊的情况下才有可能会造成定量的偏差。
能通过稀释来解决的离子抑制还不叫"基质效应";基质效应是稀释解决不了的离子抑制。关键的关键,是用什么溶液做稀释以及用什么溶液来配标准品。这个留到下一节来讲。




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