前言

      我们都知道液相色谱-质谱联用系统具有很好的灵敏度和高选择性，其中的液相色谱有很好的分离杂质与目标物的功能，而且质谱内部的气帘气和三重四级杆也有良好的去除杂质的作用。最初，有专家学者尝试将未经前处理的生物样本直接进入系统检测，但是经过大量实践发现，除了极少数情况下只需将样品进行简单处理就可以直接检测外，大部分都需要采取分离、净化、浓缩、衍生等前处理步骤，才能实现稳定、准确检测目标物的目的。样品前处理目前是临床质谱分析的一个难点和重点，成为现代快速分析的瓶颈。目前，临床质谱常用的前处理手段有蛋白沉淀、固相萃取、液液萃取、衍生等。本公众号之前有给大家介绍过固相萃取，本期主要给大家介绍下最简单的前处理——蛋白沉淀。

蛋白沉淀的定义

蛋白沉淀前处理的优势与劣势

      优势：蛋白沉淀的最主要的优势就是操作简便、成本低、易于实施。

      劣势：①此方法仅去除了蛋白质，内源性杂质并没有去除掉，长时间检测可能会对色谱柱和仪器的寿命产生影响。所以，要对色谱柱和仪器做定期维护。

                ②处理后的样本浓度会被稀释，不适用于浓度低的目标物和质谱响应偏低的情况。

临床质谱领域蛋白沉淀方法汇总

1.有机溶剂沉淀法

      此方法为临床质谱领域最常用方法，一般沉淀试剂以甲醇、乙醇、乙腈为主。个别项目会在有机溶剂中加入一定量的有机酸来提高沉淀效率。例如同型半胱氨酸的检测，一般会在有机溶剂中加入一定量的三氟乙酸或者三氯乙酸。

在做血浆或血清样品时，多用甲醇或乙腈沉淀蛋白，一般情况样本与沉淀剂的比例为乙腈最低1:2（一般1:3以上），甲醇最低1:3（一般1:5以上），有实验显示以血清：水：乙腈为1:2:4.5时去除效果最好。

      适用目标物：生物小分子、糖类。

      原理：有机溶剂的沉淀原理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。

      优点：①分辨能力比盐析法高，即蛋白质只在一个比较窄的有机浓度下沉淀；②沉淀后不用需考虑除盐，过滤较为容易。

2.盐析法

      当目标物为非蛋白质时，纯盐析法在临床质谱领域应用较少，因为沉淀后会引入高浓度盐，长时间进样的话会对仪器灵敏度和柱压产生影响。所以，一般使用盐析法沉淀后，样本还需经过稀释、减少进样量或者透析除盐等步骤。盐析法可与其他沉淀方法结合使用。

      适用目标物：盐析法沉淀出的蛋白并没有失活，所以主要用于蛋白质和酶的提取。

3.加热凝固法

      原理：将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热,可使蛋白质发生凝固( coagulation)而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性,有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构,分子的不对称性增加,疏水基团暴露,进而凝聚成凝胶状的蛋白块如煮熟的鸡蛋,蛋黄和蛋清都凝固。此方法主要选择性去除不耐热的杂蛋白。

      适用目标物：目标物需要有较强的热稳定性，例如葡萄糖。

      其余的蛋白沉淀法还有等电点沉淀法、非离子多聚物沉淀法、生成盐复合物沉淀法等，这些方法临床质谱领域应用较少，所以小编就不一一介绍了。感兴趣的小伙伴可自行了解。

蛋白沉淀法如何实现高效率、高通量处理样本

      传统操作方法为使用离心管与离心机搭配，但是此种方法需要单一处理样本，会出现效率低、人为误差等问题。所以，此方法更加适用于前期的方法开发与科研项目，不适用于样本量大的实验室的检测。

      为解决以上问题，可考虑使用排枪和96孔蛋白沉淀板进行大批量样本的前处理，效率可提高数倍。

      96孔板的操作步骤需搭配负压或正压半自动化设备，操作简便，可将分离沉淀与试剂的过程缩短至半分钟左右。排枪的使用可减少人为误差和提高效率。

      为了能让大家更直接的了解96孔板的操作流程和优势，国内知名制造厂家逗点生物技术有限公司特拍摄96孔蛋白沉淀板前处理操作流程以做展示：

深圳逗点生物技术有限公司

      深圳逗点生物技术有限公司(Biocomma Limited)成立于2006年，已形成多孔塑料、分离材料、精密注塑三大技术平台，是样品制备、样本过滤和样本采集等产品的领先制造商。

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