您好,欢迎来到临床质谱网!
临床质谱前处理 | 生物样本前处理之“蛋白沉淀”
发布日期:2020-01-07   来源:本站   浏览数:1097

前言

      我们都知道液相色谱-质谱联用系统具有很好的灵敏度和高选择性,其中的液相色谱有很好的分离杂质与目标物的功能,而且质谱内部的气帘气和三重四级杆也有良好的去除杂质的作用。最初,有专家学者尝试将未经前处理的生物样本直接进入系统检测,但是经过大量实践发现,除了极少数情况下只需将样品进行简单处理就可以直接检测外,大部分都需要采取分离、净化、浓缩、衍生等前处理步骤,才能实现稳定、准确检测目标物的目的。样品前处理目前是临床质谱分析的一个难点和重点,成为现代快速分析的瓶颈。目前,临床质谱常用的前处理手段有蛋白沉淀、固相萃取、液液萃取、衍生等。本公众号之前有给大家介绍过固相萃取,本期主要给大家介绍下最简单的前处理——蛋白沉淀



蛋白沉淀的定义

      沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。蛋白质从溶液中析出的现象,称为蛋白质的沉淀。

蛋白沉淀前处理的优势与劣势

      优势:蛋白沉淀的最主要的优势就是操作简便、成本低、易于实施。


      劣势:①此方法仅去除了蛋白质,内源性杂质并没有去除掉,长时间检测可能会对色谱柱和仪器的寿命产生影响。所以,要对色谱柱和仪器做定期维护。

                ②处理后的样本浓度会被稀释,不适用于浓度低的目标物和质谱响应偏低的情况。


临床质谱领域蛋白沉淀方法汇总

1.有机溶剂沉淀法

      此方法为临床质谱领域最常用方法,一般沉淀试剂以甲醇、乙醇、乙腈为主。个别项目会在有机溶剂中加入一定量的有机酸来提高沉淀效率。例如同型半胱氨酸的检测,一般会在有机溶剂中加入一定量的三氟乙酸或者三氯乙酸。

在做血浆或血清样品时,多用甲醇或乙腈沉淀蛋白,一般情况样本与沉淀剂的比例为乙腈最低1:2(一般1:3以上),甲醇最低1:3(一般1:5以上),有实验显示以血清:水:乙腈为1:2:4.5时去除效果最好。


      适用目标物:生物小分子、糖类。


      原理:有机溶剂的沉淀原理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。


      优点:①分辨能力比盐析法高,即蛋白质只在一个比较窄的有机浓度下沉淀;②沉淀后不用需考虑除盐,过滤较为容易。


2.盐析法

      当目标物为非蛋白质时,纯盐析法在临床质谱领域应用较少,因为沉淀后会引入高浓度盐,长时间进样的话会对仪器灵敏度和柱压产生影响。所以,一般使用盐析法沉淀后,样本还需经过稀释、减少进样量或者透析除盐等步骤。盐析法可与其他沉淀方法结合使用。


      适用目标物:盐析法沉淀出的蛋白并没有失活,所以主要用于蛋白质和酶的提取。


3.加热凝固法

      原理:将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热,可使蛋白质发生凝固( coagulation)而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性,有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构,分子的不对称性增加,疏水基团暴露,进而凝聚成凝胶状的蛋白块如煮熟的鸡蛋,蛋黄和蛋清都凝固。此方法主要选择性去除不耐热的杂蛋白。


      适用目标物:目标物需要有较强的热稳定性,例如葡萄糖。


      其余的蛋白沉淀法还有等电点沉淀法、非离子多聚物沉淀法、生成盐复合物沉淀法等,这些方法临床质谱领域应用较少,所以小编就不一一介绍了。感兴趣的小伙伴可自行了解。


      目前常见的临床质谱项目中应用蛋白沉淀作为前处理的有药物检测(极大多数)、同型半胱氨酸、甲状腺激素、葡萄糖、水溶性维生素等。


蛋白沉淀法如何实现高效率、高通量处理样本

      传统操作方法为使用离心管与离心机搭配,但是此种方法需要单一处理样本,会出现效率低、人为误差等问题。所以,此方法更加适用于前期的方法开发与科研项目,不适用于样本量大的实验室的检测。

      为解决以上问题,可考虑使用排枪和96孔蛋白沉淀板进行大批量样本的前处理,效率可提高数倍。


      96孔板的操作步骤需搭配负压或正压半自动化设备,操作简便,可将分离沉淀与试剂的过程缩短至半分钟左右。排枪的使用可减少人为误差和提高效率。


      为了能让大家更直接的了解96孔板的操作流程和优势,国内知名制造厂家逗点生物技术有限公司特拍摄96孔蛋白沉淀板前处理操作流程以做展示:



深圳逗点生物技术有限公司

      深圳逗点生物技术有限公司(Biocomma Limited)成立于2006年,已形成多孔塑料、分离材料、精密注塑三大技术平台,是样品制备、样本过滤和样本采集等产品的领先制造商。


      公司已通过ISO9001:2015质量管理体系认证,被评为国家高新技术企业。公司拥有三个工厂和三个实验室,提供1500多种产品。十余年来,我们已服务于4000多个客户,并为全球数十个知名品牌提供OEM和定制服务。

我要留言
*登录后留言!   会员请登录,不是会员请注册
客服

QQ客服:3602981236 (在线咨询)


工作日 : 9:00-22:00 
节假日 : 9:00-18:00


微信客服:LC-MS-MS (添加咨询)


工作日 : 9:00-22:00

节假日 : 9:00-18:00

微信
公众号

扫码关注公众号,了解更多

实用工具
有奖投稿