文章来源：中华检验医学杂志, 2026, 49(6): 710-716.

作者：徐程 陈建起 李本柏 李海明 曹春玲 何紫云 鄢仁晴 鄢盛恺

摘

目的 建立一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测血清中7种水溶性维生素的方法，并进行性能评价。

方法 前瞻性观察性研究。收集2024年6月1日至2025年7月1日在遵义医科大学附属医院80名进行健康体检人群［（男性42名，女性38名），年龄38（29，48）岁］的血清样本，用于方法验证及质控品制备。另收集2025年8月1日至2025年9月1日在广州丰华医学检验实验室40名体检健康人群［（男性20名，女性20名），年龄35（27，45）岁］的血清样本，采用分割样品法进行外部验证。血清样本经蛋白沉淀后，使用T3色谱柱以0.3 ml/min流速进行梯度分离，采用LC-MS/MS对血清中维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7及维生素C进行定量检测，同时对方法的线性范围、定量限、精密度、正确度、携带污染率及稳定性进行评价。

结果 7种水溶性维生素的标准曲线线性良好，均 r>0.990，定量限满足临床检测需求；批内及批间精密度为0.45%~9.65%，满足<15%的准则；回收率范围为86.04%~111.76%，满足85%~115%的正确度要求；携带污染率在-8.45%~10.81%，满足低于20%的要求；质控品及校准品在规定条件下均能稳定保存3 d。外部验证显示，两个不同实验室采用两种不同检测系统结果具有相关性，均 r≥0.99，95%一致性界限（0.859~1.139）在允许总误差内。

结论 本研究建立了一种检测人血清中7种水溶性维生素的LC-MS/MS测定方法，可满足水溶性维生素精准定量分析的需求。

水溶性维生素包含8种B族维生素及维生素C（vitamin C，VC），是人体中参与多种代谢与调节过程的必需微量营养素[1 , 2 , 3]。这些维生素的血清浓度是评估营养状况的客观生物标志物，缺乏这些维生素可导致贫血、神经系统损伤等一系列疾病[4 , 5 , 6 , 7]。因此，建立准确、可靠且高效的定量分析方法尤为重要。

传统水溶性维生素的检测方法包括微生物法、免疫法、色谱法及电泳法等[8]。但这些方法存在局限，微生物测定法太过依赖于待测物对微生物的活性，缺乏对维生素形式的特异性和选择性，耗时且精度和准确度较差[9]；免疫法易受抗体特异性的影响，且无法有效区分同分异构体；常规色谱法灵敏度有限，难以满足痕量分析需求[10]。相比之下，液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）凭借其高选择性、高灵敏度及多组分同时分析的优点，已成为用于检测维生素的主要分析技术[8 , 9]。然而，国内现有文章报道基于LC-MS/MS的血清水溶性维生素检测方法，其在覆盖的维生素种类仍有限[11]。维生素B9和B12以多种功能各异的衍生物形式天然存在，且这些衍生物普遍存在化学性质不稳定、结构相似、在生物样本中含量极低等问题。基于此，本研究建立了一种基于LC-MS/MS同时检测人血清中7种水溶性维生素［维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黄素）、维生素B3（烟酰胺）、维生素B5（泛酸）、维生素B6（吡哆酸）、维生素B7（生物素）及VC］含量的方法并系统验证其性能，为相关疾病的筛查与诊疗提供技术参考。

01 对象与方法

一、对象

本研究为前瞻性观察性研究，已通过遵义医科大学附属医院医学伦理委员会审批（KLLY-2024-050）。利用无法联系到受试者的血清样本进行研究，且不涉及个人隐私和商业利益，经过严格伦理审查后免除签署知情同意书。前瞻性收集2024年6月1日至2025年7月1日遵义医科大学附属医院80名体检健康人群血清样本［男性42名，女性38名，年龄38（29，48）岁］，用于方法学研究。另收集2025年8月1日至9月1日广州丰华医学检验实验室40名体检健康人群血清样本［男性20名，女性20名，年龄35（27，45）岁］，用于方法外部验证。

1. 纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）无明显机体功能障碍；（3）传染病检查结果为阴性。

2. 排除标准：（1）妊娠/哺乳期女性；（2）身体处于炎症状态；（3）患有肝肾疾病、消化系统疾病；（4）脂血、黄疸及溶血样本。

二、方法

1. 主要仪器与试剂：UPLC Xevo TQS液相色谱-串联质谱仪（美国 Waters 公司）；AB SCIEX 3200 液相色谱-串联质谱仪（美国 AB SCIEX 公司）；维生素B1（盐酸硫胺素，99.9%）、B2（核黄素，98.10%）、B3（烟酰胺，99.6%）、B5（D-泛酸钙，99.1%）、B6（4-吡哆酸，100.0%）、B7（生物素，99.2%）、VC（L-抗坏血酸，100.0%）标准品均采购自美国Sigma公司。B1- 13C 4（99.46%）、B2- 13C 4 15N 2（96.20%）、B3-d 4（99.29%）、B5- 13C 6 15N 2（98.90%）、B6-d 3（97.00%）、B7-d 4（99.98%）、VC- 13C 6（100.00%）采购自上海甄准生物科技公司。质谱级甲醇、甲酸以及三氯乙酸均采购自美国Sigma公司，实验用水为超纯水。实验耗材：MicroPulite Perfect T3色谱柱2.1 mm×100 mm，3.0 μm（广州微纯生物科技公司）；水溶性维生素测定试剂盒（超高效液相色谱-串联质谱法）购自山东英盛生物技术有限公司，该试剂盒适用于AB SCIEX 3200液相色谱串联质谱仪，配套提供提取液、流动相、校准品、质控品及内标等成分。

2. 样品预处理：血清分离后应立即检测，若无法立即检测，须将血清转移至棕色离心管中，于-20 ℃条件下短期保存，注意避免反复冻融。若需转运，应采用干冰或-20 ℃冷链运输，确保样本全程低温避光。处理过程均需在避光条件下进行，以避免维生素光降解。

3. 制备标准品：分别精确称取维生素B1、B3、B5标准品各1 mg，溶于1 ml甲醇；维生素B6（1 mg）溶于1 ml无水乙醇；维生素B7（1 mg）溶于1 ml二甲基亚砜；维生素B2（1 mg）与VC（20 mg）溶于1 ml 10%甲醇水，于-20 ℃保存。采用含2.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）溶液配制混合标准品储备液（维生素B1、B2、B3、B6均为1 μg/ml，B5为13 μg/ml，B7为0.2 μg/ml，VC为1 mg/ml）。

4. 制备内标品：同位素内标品（B1- 13C 4、B3-d 4、B5- 13C 6 15N 2各1 mg溶于1 ml甲醇；B6-d 3 1 mg溶于1 ml无水乙醇；B7-d 4 1 mg溶于10 ml二甲基亚砜；B2- 13C 4 15N 2与VC- 13C 6各1 mg溶于1 ml 10%甲醇水）经配制后，用10%甲醇水制备成混合内标储备液（B1- 13C 4、B2- 13C 4 15N 2、B3-d 4、B6-d 3均为1 μg/ml，B5- 13C 6 15N 2为2 μg/ml，B7-d 4为0.1 μg/ml，VC- 13C 6为10 μg/ml）。

5. 制备内标工作液：以2.5% BSA的PBS溶液对混合标准品储备液进行梯度稀释（10、20、40、100、200、1 000、2 000倍），制得标准曲线工作液。将同位素内标储备液与饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、10%三氯乙酸按1∶1∶100体积比混合，配成内标工作液。所有工作液分装后-20 ℃保存备用。

6. 质控品制备：将不同样本充分混匀制备混合血清，并对本底值进行测定，分为3份。分别向混合血清中加入不同浓度化合物标准品制备成低、中、高3个浓度质控品，分装后放置于-20 ℃冰箱备用。

7. 样品前处理：取样本、校准品、质控品平衡至室温。精准移取样本、校准品及质控品各100 μl，分别加入对应的1.5 ml离心管中，向每管中加入100 μl同位素内标工作液。涡旋振荡1 min，在4 ℃下以16 173× g离心5 min，取上清液120 μl转移到96孔V型底深孔板中，离心后上机检测、分析。

8. 色谱分析条件：色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm），柱温40 ℃，流动相A为5 mmol/L的乙酸铵水溶液，流动相B为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸的甲醇溶液，以流速0.3 ml/min进行洗脱，流动相洗脱梯度见 表1 。

9. 质谱分析条件：采用正离子电喷雾离子化模式（ESI+），多反应监测（MRM）的扫描方式，进样量为5 μl，主要参数见 表2 。

三、方法学评价

方法学评价参考文献［ 12 , 13 ］进行操作。

1. 线性评估：将混合标准品储备液分别稀释10、20、40、100、400、1 000、2 000倍，制备成7个浓度的工作液，每个浓度点进行3次重复检测。每个浓度点检测偏倚要求在±15%范围内，以标准液中分析物与对应内标色谱峰的峰面积比为纵坐标，分析物浓度作为横坐标，使用最小二乘法（权重系数1/ x²）进行线性拟合，相关系数（ r）>0.990为线性关系良好。

2. 精密度：对低、中、高3个浓度的质控品进行检测，每个浓度分析3个批次，每批5个样本，以评估批内精密度；并对质控品进行连续3 d的检测，每次5份样本，以评估批间精密度，要求批内及批间精密度均需<15%。

3. 正确度：通过加标回收实验评估方法的正确度，向已知浓度样本中加入低、中、高3个浓度混合标准品溶液，制备出3个浓度加标样本各5份，每份检测3次，计算各浓度的加标回收率，回收率在85%~115%可接受。

4. 定量限：使用BSA模拟血清基质，制备一系列接近方法线性范围定量下限浓度的样本，针对每一候选浓度，独立配制5份平行样本并进行完整的前处理与检测，连续测定3 d；将满足信噪比（S/N）≥10、测定均值与理论值相对偏差在±15%以内、且变异系数（coefficient of variation， CV）≤20%的最低浓度确立为方法的定量限。

5. 携带污染率：首先进行重复的低浓度样本（定量下限）进样检测，记录检测结果均值（L pre）；接着交替进行高浓度样本（定量上限）、低浓度样本检测（以高高低形式重复5个循环，记录检测结果均值L post）。比较连续进样的低浓度样本与交替进样的低浓度样本之间检测结果的差异，携带污染率=［（L pos-L pre）÷L pre］×100%，结果<20%为可接受。

6. 稳定性实验：评估血清中7种水溶性维生素在样本处理前及处理后的稳定性。处理前稳定性考查低、高两个浓度质控品分别放置于室温4 h，2~8 ℃冰箱24 h、72 h及-20 ℃冰箱72 h与配置时的测定结果；处理后稳定性考查处理后两个浓度质控品放置于2~8 ℃与首次测定值的偏差，偏差需在±15%以内。

7. 方法外部验证：由于国内尚无针对多种水溶性维生素的室间质量评价计划，采用分割样品法对方法进行外部验证。利用所收集的40份临床血清样本，分别在本院实验室所建立LC-MS/MS法（采用UPLC Xevo TQS液相色谱-串联质谱检测系统），与广州丰华医学检验实验室所用LC-MS/MS法（采用AB SCIEX 3200液相色谱-串联质谱检测系统及山东英盛生物技术有限公司的商品化水溶性维生素测定试剂盒）进行7种水溶性维生素检测。对两个实验室两种不同检测系统的检测结果进行回归分析，计算回归方程及 r；同时进行Bland-Altman分析评价方法一致性，计算两两实验室的检测结果的比值的95%一致性界限，设定允许总误差为±15%（允许范围为0.85~1.15）。

四、统计学分析

采用SPSS 29.0统计软件进行统计学处理及数据分析，计算均值、标准差、CV、回收率和偏倚；使用Origin 2024软件绘制色谱图；使用MedCalc 23.0进行回归分析及Bland-Altman分析。

02 结果

一、色谱图

体检健康人群血清样本经蛋白沉淀后7种水溶性维生素色谱峰见 图1 。所有水溶性维生素峰形良好，未见明显干扰。

二、方法学评价

1. 线性评估与定量限：7种分析物在标准曲线范围内线性良好，均 r>0.990，所有项目的定量限均可满足临床对相应维生素的检测灵敏度要求（ 表3 ）。

2. 精密度和正确度：所有分析物批内及批间偏差在15%以内，表明方法精密度良好。通过加标回收实验验证方法正确度见 表4 。B1、B2、B3、B5、B6、B7和VC原始样本浓度分别为2.53、24.81、25.52、32.22、10.27、1.04、5894 ng/ml。

3. 携带污染：维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7及VC的携带污染率分别为10.81%、-0.34%、-0.88%、-0.38%、8.01%、-8.45%、1.36%，均满足<20%的判定标准。

4. 稳定性：7种水溶性维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7及VC的样品处理前的稳定性偏差分别为：B1（-3.59%~-0.57%）、B2（-1.39%~3.52%）、B3（0.70%~2.93%）、B5（-2.43%~3.79%）、B6（-0.34%~4.42%）、B7（-1.47%~4.59%）、VC（-5.70%~-1.52%）；样品处理后的稳定性偏差分别为：B1（-7.94%~-1.12%）、B2（-3.57%~4.15%）、B3（-3.57%~0.32%）、B5（-2.74%~-2.11%）、B6（-6.25%~-1.34%）、B7（1.05%~2.95%）、VC（-6.78%~-2.21%），所有物质均符合±15%的判定标准（ 表5 ）。低浓度质控品浓度分别为B1 5.24 ng/ml、B2 5.38 ng/ml、B3 28.08 ng/ml、B5 33.11 ng/ml、B6 10.38 ng/ml、B7 1.02 ng/ml、VC 5 928 ng/ml，高浓度质控品浓度分别为B1 24.63 ng/ml、B2 24.71 ng/ml、B3 52.37 ng/ml、B5 162.18 ng/ml、B6 49.94 ng/ml、B7 5.07 ng/ml、VC 27 475 ng/ml。此外，本研究对7个浓度点的混合校准品在-20 ℃及2~8 ℃条件下的稳定性进行了评估，结果显示，在-20 ℃保存3 d，各浓度点测定值与初始值的相对偏差范围为-4.67%~5.93%；在2~8 ℃保存3 d，相对偏差范围为-5.21%~5.63%，所有偏差均符合±15%的接受标准。表明校准品在上述条件下至少可稳定3 d，满足临床检测的稳定性要求。

6. 外部验证结果：相关性分析结果表明，两个不同实验室采用两种不同检测系统测定结果的相关系数分别为：B1（0.999）、B2（0.998）、B3（0.997）、B5（0.998）、B6（0.998）、B7（0.998）及VC（0.998），均表现出良好的相关性；Bland-Altman分析表明，两个实验室95%的样本比值落在0.859~1.139范围内，具有良好的一致性和相关性，方法通过外部验证（ 表6 ）。

03 讨论

水溶性维生素作为维生素的重要部分，是人体生长发育、新陈代谢等生命活动所必需的微量营养素，在多种酶促反应中充当辅酶，支持细胞各项生理活动[14]。近年来，维生素检测技术越发成熟，已从单一成分的检测发展为多维生素同步分析，分析方法在灵敏度与检测效率上得到提升。

水溶性维生素稳定性较差，易受光照、温度与pH等影响发生降解。因此，我们所有操作均在棕色离心管或避光条件下进行，并尽可能控制低温环境。前处理是水溶性维生素定量的关键环节，直接影响方法的灵敏度、准确度等重要性能指标[15]。目前与LC-MS/MS联用的常用样本前处理方法包括蛋白沉淀法、萃取法、磁珠法、超滤法等[16 , 17 , 18 , 19]。对于临床样本（血清、血浆）中水溶性维生素的快速、高通量检测需求，蛋白沉淀法因其操作简便、处理速度快、成本低廉等优势，被认为是更适宜的选择。各水溶性维生素之间极性、理化性质等差异较大，在反相色谱柱中的保留能力较差，血清中的内源性干扰物质等，都会增加LC-MS/MS对各化合物的定量难度。与现有方法相比，本研究在检测项目组合、关键性能与操作效率上取得了综合改进。Gu等[20]建立的方法虽可同步检测6种B族维生素并实现自动化提取，但其未包含对维生素B1及VC的检测。本研究通过优化前处理与检测条件，成功实现了对维生素B1及VC的可靠定量。相较于Huo等[21]检测8种B族维生素的方法，本研究虽减少了部分B族种类，但将维生素C 这一不可或缺的营养指标纳入，建立了同时检测7种水溶性维生素（B1、B2、B3、B5、B6、B7及VC）的方案，更贴合临床综合评估需求。此外，在操作效率上，相较于Huo等[21]方法中先蛋白沉淀再氮气吹干、复溶等步骤，本研究采用的蛋白沉淀法前处理更为快捷，且总检测时间缩短至5 min，提升了高通量检测的实用性。由于B9和B12的理化性质与本研究中其他维生素差异较大，难以在同一方法中兼顾。未来研究可进一步优化色谱质谱条件，拓展检测谱，以实现更全面的维生素谱一站式检测。

参考文献 略