随着空间蛋白质组学研究热度持续攀升，越来越多的科研团队正着力开发基于质谱分析的无偏测量方法。这类创新技术相较于传统的抗体依赖型方法，在蛋白覆盖深度上实现了显著突破。 

当前主流的空间蛋白质组学平台多采用抗体技术路线，这类方法虽已取得系列研究成果，但受限于商业试剂库的可用性，单次实验通常只能检测50至100种蛋白质靶标。而基于质谱的无偏分析技术则展现出革命性优势——单次实验即可完成数千种蛋白质的定量分析。

 这项技术因突破性进展荣获2024年《自然·方法》年度方法奖，现已引发学术界与产业界的双重关注。包括阿克奥雅生物科技（近期被昆特瑞克斯收购）、标准生物工具、布鲁克、离子路径、生物泰克、赛默飞世尔科技及10x基因组学在内的多家企业，均已推出商业化空间蛋白质组学解决方案。 

值得注意的是，现有主流平台仍以抗体技术为核心，这在很大程度上限制了研究者的选择自由度。相比之下，无偏质谱技术展现出显著的技术优势：卡罗林斯卡医学院医学生物化学与生物物理学系助理教授弗洛里安·罗森伯格介绍，其团队在马克斯·普朗克生物化学研究所马蒂亚斯·曼教授实验室开发的高通量可视化蛋白质组学（DVP）技术，能够实现单样本高达8000种蛋白质的精确定量分析。

南方科技大学（SUSTech）教授田瑞军表示，其实验室采用的空间与细胞类型蛋白质组学（SCPro）方法，基于无偏质谱技术，已实现单次实验对约3000至4000种蛋白质的定量分析。该方法与前述DVP技术同属质谱导向的无偏分析范式。 在2024年1月发表于《自然·通讯》的研究中，美国西北太平洋国家实验室团队展示了其wcSOP空间蛋白质组学技术的突破性能力——在人类脾脏组织中成功鉴定出多达4600种蛋白质。 

科学家们在纽约州立大学布法罗分校利用朱俊教授开发的微支架辅助空间蛋白质组学（MASP）技术，已在小鼠脑组织中实现了约5000种蛋白质的空间映射。 一般来说，无偏空间蛋白质组学方法通过从单个细胞或少量组织细胞中提取并分析蛋白质，使这些蛋白质能够追溯至特定细胞及其在组织内的位置。近年来，人工智能和激光显微切割等技术的发展，使得研究者能够以更快速、更高效的方式对细胞进行特征识别与目标选择。

以深度视觉蛋白质组学（DVP）方法为例，该技术将传统细胞染色与人工智能图像分析相结合，用于识别目标细胞或细胞群。随后通过自动化激光显微切割（LMD）分离目标细胞，并通过质谱技术进行蛋白质组分析。 

SCPro技术则采用多色免疫组化（IHC）对厘米级组织切片进行染色，再通过算法识别细胞核和细胞膜。随后利用自动化激光显微切割（LMD）分离单细胞，并通过质谱技术开展分析。 这种无偏方法提供的覆盖深度带来了"相当丰富的生物学信息"，罗森伯格表示。不过这种方法存在通量受限的权衡。 "目前我们每天最多只能合理处理80个样本，"他说，"如果要对完整组织进行单细胞分辨率测绘，这将会耗费极长时间。" 罗森伯格称其团队正在尝试通过开发细胞聚类方法来解决这一问题。"无需对每个细胞都进行单独测量，但可以根据形态学特征对细胞进行分组，从而在组织内实现有意义的分层生物学分析，"他表示。

罗森伯格举了他与同事近期提交发表的关于α-1抗胰蛋白酶缺乏症研究的例子。这种遗传性疾病会导致肝细胞内形成蛋白质聚集体并最终杀死细胞。研究中，他们通过成像病变组织，并利用卷积神经网络对是否存在聚集体及其结构特征进行细胞聚类分析，随后切割这些不同类别的细胞并进行蛋白质组学分析。 "这为我们提供了新的数据粒度...但这并非完整的空间映射，"罗森伯格表示，"更多是基于组织学特征的蛋白质组学图谱。" 在SCPro方法中，田瑞军团队结合免疫组化染色、细胞形态学特征和组织定位数据，从厘米级组织切片中选择目标细胞。他们识别出60至100个"表型匹配"的细胞群体，将这些细胞切割后混合进行质谱实验，从而平衡了通量、覆盖深度以及细胞和空间分辨率。 "通过这三类数据维度，"田教授表示，"能够捕捉所有组织异质性特征。" 纽约州立大学布法罗分校研究团队的MASP方法则采用不同的策略，利用3D打印微支架将组织切片分割成独立微区进行处理。在他们最初的方法描述论文中，使用的微支架包含900个独立的400微米微孔，不过目前正致力于开发更高空间分辨率的支架系统。 

样本制备同样是无偏空间蛋白质组学方法面临的主要挑战之一，由于这类实验通常涉及极少量材料。部分研究者借鉴了单细胞蛋白质组学中的常用样本制备方法，例如由杨百翰大学瑞恩·凯利教授研发的纳米滴单细胞蛋白质组学（nanoPOTS）技术。 美国西北太平洋国家实验室高级科学家石吐金指出，单纯收集经激光显微切割（LMD）分离的单细胞也存在困难。石吐金及其团队开发了其湿法单微组织块采集与表面活性剂辅助一步法（wcSOP）样本处理技术，旨在解决相关挑战。 PCR管盖常被用于收集通过LMD切取的微小组织块（voxel）。通常，微组织块会捕获在管盖顶部，之后转移至管底进行样本处理。然而石吐金团队在研究中发现，许多情况下微组织块无法有效从管盖转移到管底。通过显微镜追踪微组织块的转移路径，他们发现这些样本会在PCR管多个位置卡住，导致结果重现性差。 为解决这一问题，他们开发了优化的样本采集流程：在采集微组织块前，预先在管盖中加入样本处理所需缓冲液。待样本在管盖内完成处理后，通过离心将消化后的肽段转移至管底。 该方法实现了简单且稳健的样本采集与处理流程，"即使对于空间蛋白质组学经验有限的质量谱实验室而言也适用"，石吐金表示。 

质谱灵敏度仍是罗森伯格提及的主要限制因素，尤其在单细胞水平测量时。他指出，虽然其实验室能在肝细胞等大型细胞中完成约4000种蛋白质的测定，但对中性粒细胞等小型细胞的检测仍面临困难。 "我们虽能很好分离这些细胞，但从极少量材料中获取有效数据却充满挑战，"他表示。 罗森伯格提到，近期质谱仪器的迭代如赛默飞世尔科技的Orbitrap Astral正在改善这一局面。 "这带来了重大改变，"他说，"如今我们能从单细胞中获得更丰富的生物学数据。随着技术持续发展，配合更先进的质谱仪器，检测深度必将进一步提升。" 田瑞军指出，空间蛋白质组学研究中常用的福尔马林固定石蜡包埋组织对质谱分析而言极具挑战性。SCPro方法采用基于固相离子交换的蛋白质聚集捕获（iPAC）工作流，显著提升了这类样本的蛋白提取效率。 

田瑞军团队目前正在推进SCPro工作流的自动化进程，利用经过充分注释的癌症组织样本训练人工智能代理识别目标区域与细胞，并通过激光显微切割（LMD）进行分离。 "我们希望这能成为高效完成此类分析的方法，"他表示，"这是一个极具挑战性的目标，但我们期待未来五年内实现该技术。" 田瑞军还在研究基于邻近标记的空间蛋白质组学方法，该方法可对特定细胞类型的蛋白质进行标记并提取用于质谱分析。 邻近标记技术通常利用目标蛋白将邻近蛋白质标记上生物素等分子，从而实现从细胞中提取并分析这些蛋白质。田瑞军提出，该方法可用于例如在整厘米级样本中一次性标记所有携带特定细胞标志物的CD45阳性T细胞，随后通过质谱进行检测。 "例如，我们可以对整个厘米级样本中所有CD45阳性的T细胞进行统一标记，"他表示。

该技术与台湾Syncell公司的微勺（Microscoop）空间蛋白质组学平台类似，允许用户对目标细胞区域的蛋白质进行生物素标记，随后通过质谱或其他方法进行提取分析。 通过微勺系统，研究人员可通过免疫荧光标记目标区域的分子标志物，或识别该区域的解剖标志物来定位目标细胞区域。系统随后对标记样本成像并生成定义目标蛋白提取区域的光学掩膜。用户随后应用Syncell称为"Synlight Rich试剂盒"的光生物素化试剂，该试剂在光照下与蛋白质结合。通过激光照射光学掩膜定义的区域后，光生物素化试剂将与目标区域的蛋白质结合，最终通过链霉亲和素-生物素 pull-down 工作流完成蛋白质提取。 该公司已于2023年启动平台销售，并于去年12月完成1500万美元A轮融资。 虽然这些空间蛋白质组学工作流尚处早期阶段，但已开始产生临床影响。去年，包括曼恩在内的马克斯·普朗克研究所研究人员利用CVP方法，发现炎症性JAK/STAT通路过度激活与致命性皮肤疾病大疱性表皮松解症（TEN）之间的关联。作为该研究的共同作者，罗森伯格表示这些发现已成功指导多名患者的临床治疗。 

虽然无偏空间蛋白质组学技术的推广仍受制于工作流程的技术复杂性及所需设备高昂成本等因素，但罗森伯格表示该领域正吸引越来越多的关注。他表示，正与同事筹备一场聚焦DVP及其他技术的研讨会，计划于今年秋季在维也纳举行。 "研究群体规模持续扩大，如今正是深化合作的良好时机，"他说，"我认为对于空间蛋白质组学领域而言，这将是未来发展过程中愈发重要的方向。" 

来源: 临床质谱网根据基因网整理翻译，转载请注明出处