25羟基维生素D的前世今生及临床LC-MS/MS检测金标准
发布日期：2019-06-06 来源：ClinicalMS 临床质谱检测 浏览数：13616 人
导语
近年来，应用液相色谱-串联质谱法进行临床检测的项目当中，维生素D的检测可算得上是最火热的项目了。据调查显示，国内维生素D的临床检测逐年递增。国内的一些第三方检测中心例如金域医学，其每年应用液质联用仪检测的数量早已突破30万例！凯莱普精准医疗检测实验室也是达到了每年将近20万人次检测。还有一些三甲医院也陆陆续续开展了维生素D的质谱检测，下面为大家介绍下神奇的维生素D。
维生素D(vitamin D )为固醇类衍生物，目前被认为也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2（麦角钙化醇）和VD3（胆钙化醇）。维生素D的发现是人们与佝偻症抗争的结果。早在1824年，就有人发现鱼肝油可在治疗佝偻病中起重要作用。1918年，英国的梅兰比爵士证实佝偻病是一种营养缺乏症。但他误认为是缺乏维生素A所致。1930是维生素D年，Gottingen大学的A.Windaus教授首先确定了维生素D的化学结构，1932年经过紫外线照射麦角固醇而得到的维生素D2的化学特性被阐明。维生素D3的化学特性直到1936年才被确定。
其实除了佝偻病，维生素D缺乏甚至与癌症、糖尿病、软骨病、免疫系统疾病、精神分裂症等息息相关。医学分析表明，将维生素D摄取量增至1000 IU /d 可能降低结肠癌和乳腺癌的患病几率50%。男性摄入维生素D 400 IU /d 可大幅降低患多种癌症的几率，包括胰腺癌、食道癌和非霍奇金淋巴瘤。孩子在生命的第一年期间每天摄入2000 IU的维生素D，在30年随访期间I型糖尿病的风险降低80%。美国科学家一项新研究表明，维生素D不仅能提高骨强度，还可以防止蛀牙。据报道，全球居然有近10 亿人维生素D不足或缺乏！
那如何判断维生素D在人体内缺乏与过量呢？
维生素D在人体内的最优浓度水平尚有争议，但是大部分科学家认为浓度水平低于20μg/L（50nmol/L）定义为维生素缺乏。浓度水平在21~29μg/L（52~72nmol/L）水平可以被认为指示维生素D相对缺乏，大于150μg/L（374nmol/L）则可观察到维生素D中毒。也就是说维生素D的水平在30~150μg/L则为正常水平。
维生素D对人体既然如此重要，那它在人体中是如何吸收和作用的呢？下面我们可以从维生素D代谢途径进行了解。
常见富含维生素D的食物推荐：海鱼和鱼卵、动物肝脏、蛋黄、奶油和奶酪等。
哪些人需要补充维生素D？
都市中，特别是浓烟污染地区的人应该摄取更多的维生素D。 写字楼职员、夜间工作者或因为服装、生活工作方式而不能充分得到阳光的人要特别注意在饮食中增加维生素D。 素食者、婴幼儿和老人需要补充维生素D。
好了，普及了那么多有关维生素D的知识，那临床检测维生素D都有什么方法呢？
优点：初始投入成本低、高自动化、重现性好；
缺点：特异性不高，不能准确测定25羟基维生素D2的含量；测试样本成本较高；回收率较差；
2.酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）或化学发光免疫法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）
优点：检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等；
缺点：特异性和灵敏度不高、操作繁琐费时；
3.高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）
优点：分离效果好、速度快等；
缺点：基质效应严重、不能很好的定性等；
4.液相色谱串联质谱法（Liquid chromatography –tandem mass spectrometry method, LC-MS/MS）
优点：国际上维生素D检测的金标准！具有灵敏度高、专属性强、能同时监测25-羟维生素D2和25-羟维生素D3；
缺点：初始投入成本高、对操作人员技术要求高；
同时检测25（OH）D2和25（OH）D3的意义何在？
25（OH）D是机体维生素D的主要储存形式，占总量的95%以上。由于其半衰期长（2~3周），并且不受血钙和甲状旁腺素水平的影响，因此被公认为是客观评价维生素D营养状况的最佳指标。
2010年，来自临床和实验室的专家们共同推荐25（OH）D的检测方法应能同时检测出25（OH）D2和25（OH）D3，以保证来源于植物或动物的维生素D补充均能够被检测出。因此，临床实验室需要选择一种可以同时识别2种25（OH）D形式的检测方法。
为了解决维生素D检测面临的实际问题，提供给临床更准确的信息，保障患者的医疗安全，美国国立卫生研究院（the National Institutes of Health，NIH）营养健康办公室（the Office of Dietary Supplements，ODS）与美国疾病预防控制中心（the Center for Disease Control and Prevention，CDC）、美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）和比利时根特大学一同合作，启动了维生素D标准计划(The Vitamin D Standardization Program, VDSP)。
接下来我把VDSP参考测量体系的组成部分中参考测量程序和性能验证程序详细介绍下：
参考测量程序：NIST和比利时根特大学先后建立了同位素稀释- 液相串联质谱法（isotope-diluted-liquid chromatography tandemmass spectrometry，ID-LC-MS/MS）检测25（OH）D[包括25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi-25（OH）D]的参考方法，并被国际标准化组织认证并纳入检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）数据库中。
引用：
[1] Qin W, Holick M F, Sorensen W, et al. Vitamin D3 Treatment Influences PGE2 and TGFβ in Normal and Increased Breast Cancer Risk Women[J]. Anticancer Research, 2016, 36(10):5347.
[2] Holick M F. Vitamin D and Health: Evolution, Biologic Functions, and Recommended Dietary Intakes for Vitamin D[M]// Vitamin D. Humana Press, 2010.
[3]宋亮年.1,25(OH)2维生素D3的免疫调节作用 [J].生理科学进展, 1994.
[4] Kong Y, Zheng J, Zhang W, et al. The relationship between vitamin D receptor gene polymorphism and deciduous tooth decay in Chinese children[J]. Bmc Oral Health, 2017.
[5] Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med2007; 357:266-81; PMID:17634462; http://dx.doi.org/10.1056/NEJMra070553
[6] Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA,Gordon CM, Hanley DA, Heaney RP, Murad MH,Weaver CM; Endocrine Society. Evaluation, treatment,and prevention of vitamin D deficiency:an Endocrine Society clinical practice guideline.J Clin Endocrinol Metab 2011; 96:1911-30;PMID:21646368; http://dx.doi.org/10.1210/jc.2011-0385
[7] Cashman K D. Vitamin D: Dietary requirements and food fortification as a means of helping achieve.[J]. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2015, 148.
[8] SOUBERBIELLE JC，BODY JJ，LAPPE JM，et al. Vitamin D and musculoskeletal health，cardiovascular disease，autoimmunity and cancer：recommendations for clinical practice[J]. AutoimmunRev，2010，9（11）.
[9] CARTER GD，CARTER R，JONES J，et al. How accurate are assays for 25-hydroxyvitamin D? Data from the international vitamin D external quality assessment scheme[J]. Clin Chem，2004，50（11）.
[10] HOLLIS BW. Editor ial：the determination of circulating 25-hydroxyvitamin D： no easy task[J]. J Clin Endocrinol Metab，2004，89（7）.
[11] C A RT E R G D，J O N E S J C，B E R RY J L . The anomalous behaviour of exogenous 25-hydroxyvitamin D in competitive binding assays[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2007，103（3-5）.
[12] SEMPOS CT，VESPER HW，PHINNEY KW，et al. Vitamin D status as an international issue： national surveys and the problem of standardization[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl，2012，243.
[13] VESPER HW，THIENPONT LM. Traceability in laboratory medicine[J]. Clin Chem，2009，55（6）：1067-1075.
[14] THIENPONT LM，STEPMAN HC，VESPER HW. Standardization of measurements of 25-hydroxyvitamin D3 and D2[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl，2012，243：41-49.
[15] HOLICK MF. Vitamin D status：measurement，interpretation，and clinical application[J]. Ann Epidemiol，2009，19（2）：73-78.
[16] TA I S S，B E D N E R M，P H I N N E Y KW.Development of a candidate reference measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitaminD3 and 25-hydroxyvitamin D2 in human serum using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Chem，2010，82（5）：1942-1948.
[17] ST EPMAN HC，VANDER ROOST A，VANUYTFANGHE K，et al. Candidate reference me a s u r eme n t p r o c e d u r e s f o r s e r um 2 5 -hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 by using isotope-dilution liquid chromatography-tandemmass spectrometry[J]. Clin Chem，2011，57（3）：441-448.
[18] 周琰, 潘柏申. 维生素D 检测标准化进程[J]. 检验医学, 2016, 31(1).
[19] Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory quality assurance and standardization programs：hormone standardization program [EB/OL]. （2014-12-16）[2015-01-30]. http：// www.cdc.gov /labstandards/hs.html.
有关维生素D的内容就先介绍到这，期待大家的留言与交流！
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近年来，应用液相色谱-串联质谱法进行临床检测的项目当中，维生素D的检测可算得上是最火热的项目了。据调查显示，国内维生素D的临床检测逐年递增。国内的一些第三方检测中心例如金域医学，其每年应用液质联用仪检测的数量早已突破30万例！凯莱普精准医疗检测实验室也是达到了每年将近20万人次检测。还有一些三甲医院也陆陆续续开展了维生素D的质谱检测，下面为大家介绍下神奇的维生素D。
维生素D的发现之旅
维生素D(vitamin D )为固醇类衍生物，目前被认为也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2（麦角钙化醇）和VD3（胆钙化醇）。维生素D的发现是人们与佝偻症抗争的结果。早在1824年，就有人发现鱼肝油可在治疗佝偻病中起重要作用。1918年，英国的梅兰比爵士证实佝偻病是一种营养缺乏症。但他误认为是缺乏维生素A所致。1930是维生素D年，Gottingen大学的A.Windaus教授首先确定了维生素D的化学结构，1932年经过紫外线照射麦角固醇而得到的维生素D2的化学特性被阐明。维生素D3的化学特性直到1936年才被确定。
其实除了佝偻病，维生素D缺乏甚至与癌症、糖尿病、软骨病、免疫系统疾病、精神分裂症等息息相关。医学分析表明，将维生素D摄取量增至1000 IU /d 可能降低结肠癌和乳腺癌的患病几率50%。男性摄入维生素D 400 IU /d 可大幅降低患多种癌症的几率，包括胰腺癌、食道癌和非霍奇金淋巴瘤。孩子在生命的第一年期间每天摄入2000 IU的维生素D，在30年随访期间I型糖尿病的风险降低80%。美国科学家一项新研究表明，维生素D不仅能提高骨强度，还可以防止蛀牙。据报道，全球居然有近10 亿人维生素D不足或缺乏！
那如何判断维生素D在人体内缺乏与过量呢？
维生素D在人体内的最优浓度水平尚有争议，但是大部分科学家认为浓度水平低于20μg/L（50nmol/L）定义为维生素缺乏。浓度水平在21~29μg/L（52~72nmol/L）水平可以被认为指示维生素D相对缺乏，大于150μg/L（374nmol/L）则可观察到维生素D中毒。也就是说维生素D的水平在30~150μg/L则为正常水平。
维生素D对人体既然如此重要，那它在人体中是如何吸收和作用的呢？下面我们可以从维生素D代谢途径进行了解。
维生素D体内生理过程
图1 维生素D体内代谢过程
维生素D获取途径
常见富含维生素D的食物推荐：海鱼和鱼卵、动物肝脏、蛋黄、奶油和奶酪等。
哪些人需要补充维生素D？
都市中，特别是浓烟污染地区的人应该摄取更多的维生素D。 写字楼职员、夜间工作者或因为服装、生活工作方式而不能充分得到阳光的人要特别注意在饮食中增加维生素D。 素食者、婴幼儿和老人需要补充维生素D。
好了，普及了那么多有关维生素D的知识，那临床检测维生素D都有什么方法呢？
维生素D的检测
1.放射免疫法（radioimmunoassav, RIA）优点：初始投入成本低、高自动化、重现性好；
缺点：特异性不高，不能准确测定25羟基维生素D2的含量；测试样本成本较高；回收率较差；
2.酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）或化学发光免疫法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）
优点：检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等；
缺点：特异性和灵敏度不高、操作繁琐费时；
3.高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）
优点：分离效果好、速度快等；
缺点：基质效应严重、不能很好的定性等；
4.液相色谱串联质谱法（Liquid chromatography –tandem mass spectrometry method, LC-MS/MS）
优点：国际上维生素D检测的金标准！具有灵敏度高、专属性强、能同时监测25-羟维生素D2和25-羟维生素D3；
缺点：初始投入成本高、对操作人员技术要求高；
同时检测25（OH）D2和25（OH）D3的意义何在？
25（OH）D是机体维生素D的主要储存形式，占总量的95%以上。由于其半衰期长（2~3周），并且不受血钙和甲状旁腺素水平的影响，因此被公认为是客观评价维生素D营养状况的最佳指标。
2010年，来自临床和实验室的专家们共同推荐25（OH）D的检测方法应能同时检测出25（OH）D2和25（OH）D3，以保证来源于植物或动物的维生素D补充均能够被检测出。因此，临床实验室需要选择一种可以同时识别2种25（OH）D形式的检测方法。
维生素检测的标准化进程
为了解决维生素D检测面临的实际问题，提供给临床更准确的信息，保障患者的医疗安全，美国国立卫生研究院（the National Institutes of Health，NIH）营养健康办公室（the Office of Dietary Supplements，ODS）与美国疾病预防控制中心（the Center for Disease Control and Prevention，CDC）、美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）和比利时根特大学一同合作，启动了维生素D标准计划(The Vitamin D Standardization Program, VDSP)。
标准化的实现必须具备3个关键要素
参考测量体系的建立、溯源性的建立和终端用户的检测性能保证。VDSP对于25（OH）D标准化的实现制定了3个具体步骤，见图2。
图2 VDSP实验步骤
接下来我把VDSP参考测量体系的组成部分中参考测量程序和性能验证程序详细介绍下：
图3 VDSP参考测量体系的组成部分
参考测量程序：NIST和比利时根特大学先后建立了同位素稀释- 液相串联质谱法（isotope-diluted-liquid chromatography tandemmass spectrometry，ID-LC-MS/MS）检测25（OH）D[包括25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi-25（OH）D]的参考方法，并被国际标准化组织认证并纳入检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）数据库中。
图4 维生素D标准认证程序
引用：
[1] Qin W, Holick M F, Sorensen W, et al. Vitamin D3 Treatment Influences PGE2 and TGFβ in Normal and Increased Breast Cancer Risk Women[J]. Anticancer Research, 2016, 36(10):5347.
[2] Holick M F. Vitamin D and Health: Evolution, Biologic Functions, and Recommended Dietary Intakes for Vitamin D[M]// Vitamin D. Humana Press, 2010.
[3]宋亮年.1,25(OH)2维生素D3的免疫调节作用 [J].生理科学进展, 1994.
[4] Kong Y, Zheng J, Zhang W, et al. The relationship between vitamin D receptor gene polymorphism and deciduous tooth decay in Chinese children[J]. Bmc Oral Health, 2017.
[5] Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med2007; 357:266-81; PMID:17634462; http://dx.doi.org/10.1056/NEJMra070553
[6] Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA,Gordon CM, Hanley DA, Heaney RP, Murad MH,Weaver CM; Endocrine Society. Evaluation, treatment,and prevention of vitamin D deficiency:an Endocrine Society clinical practice guideline.J Clin Endocrinol Metab 2011; 96:1911-30;PMID:21646368; http://dx.doi.org/10.1210/jc.2011-0385
[7] Cashman K D. Vitamin D: Dietary requirements and food fortification as a means of helping achieve.[J]. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2015, 148.
[8] SOUBERBIELLE JC，BODY JJ，LAPPE JM，et al. Vitamin D and musculoskeletal health，cardiovascular disease，autoimmunity and cancer：recommendations for clinical practice[J]. AutoimmunRev，2010，9（11）.
[9] CARTER GD，CARTER R，JONES J，et al. How accurate are assays for 25-hydroxyvitamin D? Data from the international vitamin D external quality assessment scheme[J]. Clin Chem，2004，50（11）.
[10] HOLLIS BW. Editor ial：the determination of circulating 25-hydroxyvitamin D： no easy task[J]. J Clin Endocrinol Metab，2004，89（7）.
[11] C A RT E R G D，J O N E S J C，B E R RY J L . The anomalous behaviour of exogenous 25-hydroxyvitamin D in competitive binding assays[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2007，103（3-5）.
[12] SEMPOS CT，VESPER HW，PHINNEY KW，et al. Vitamin D status as an international issue： national surveys and the problem of standardization[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl，2012，243.
[13] VESPER HW，THIENPONT LM. Traceability in laboratory medicine[J]. Clin Chem，2009，55（6）：1067-1075.
[14] THIENPONT LM，STEPMAN HC，VESPER HW. Standardization of measurements of 25-hydroxyvitamin D3 and D2[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl，2012，243：41-49.
[15] HOLICK MF. Vitamin D status：measurement，interpretation，and clinical application[J]. Ann Epidemiol，2009，19（2）：73-78.
[16] TA I S S，B E D N E R M，P H I N N E Y KW.Development of a candidate reference measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitaminD3 and 25-hydroxyvitamin D2 in human serum using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Chem，2010，82（5）：1942-1948.
[17] ST EPMAN HC，VANDER ROOST A，VANUYTFANGHE K，et al. Candidate reference me a s u r eme n t p r o c e d u r e s f o r s e r um 2 5 -hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 by using isotope-dilution liquid chromatography-tandemmass spectrometry[J]. Clin Chem，2011，57（3）：441-448.
[18] 周琰, 潘柏申. 维生素D 检测标准化进程[J]. 检验医学, 2016, 31(1).
[19] Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory quality assurance and standardization programs：hormone standardization program [EB/OL]. （2014-12-16）[2015-01-30]. http：// www.cdc.gov /labstandards/hs.html.
有关维生素D的内容就先介绍到这，期待大家的留言与交流！
添加小编好友（微信号：LC-MS-MS ）邀你进入“临床质谱网-技术交流群”
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