您好,欢迎来到临床质谱网!
质谱技术—核酸检测的又一利器!
发布日期:2020-07-16   来源:本站   浏览数:251

        核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内,生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸,其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同,核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。现代生物技术发现,大部分的生理或疾病性状,都是由一系列存在于核酸序列上的基因调控而表现出来的,因此目前在抗肿瘤、抗病毒领域,核酸是最具发展潜力和最有可能获得重大突破的研究对象。


        随着基因组、转录组、代谢组、蛋白质组等多种组学的发展, 生命科学的研究从单一组分逐渐过渡到大数据分析的系统研究时代, 其特点是生物大分子分析的数据量越来越大,生物质谱、下一代测序等高通量技术在其中发挥了尤为关键的作用。作为一种快速、准确、高灵敏、耗样量少、可以精确判定分子量的技术平台, 生物质谱在蛋白质和多肽分析中的应用已经非常普及,近些年核酸的鉴定及其修饰物和复合物的质谱分析也成为了热点。


         生物质谱基本原理


        上世纪 80年代电喷雾质谱技术 (electrospray ionization mass spectrometry ESI-MS)和基质辅助激光解析电离质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS)的出现,可以在皮摩尔级甚至飞摩尔级的水平上准确分析几十万种生物大分子。


        电喷雾电离质谱


        电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI—MS)的原理在毛细管的出口处施加3—5kV的高电压,所产生的强电场使从毛细管流出的液体在气动辅助雾化过程中成为细小的带电液体微粒,随着微粒的蒸发,液滴逐渐减小,表面的电荷强度逐渐增大,当电荷问排斥力克服表面张力时液滴发生裂分,成为带多个电荷的离子,经过这样反复溶剂挥发一液滴裂分的过程,最后产生单个的单电荷或多电荷离子,被质谱检测。


        ESI—MS既可分析大分子也可分析小分子物质,对于分子量在1000Da以下的小分子会产生[M+H]或者[M—H]一离子,而高达20000Da的核酸等大分子物质在ESI—MS中生成一系列多电荷离子,也可在常规质谱的m/z检测范围内被检测,通过一定的数据处理能够得到样品的分子量,其准确度优于±0.01%。 


        生物大分子电喷雾离子化的特点是产生多电荷离子而不是碎片离子,使质荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的m/z范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势是可以方便地与多种分离技术联用,如液一质联用(LC—MS)、毛细管电泳一质谱联用(CE—MS)等。


         基质辅助激光解吸电离质谱


        基质辅助激光解吸电离质谱(matrix assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry,MALDI— MS)的基本原理是将分析物分散在基质分子中使二者形成共结晶,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射而吸收能量,导致能量蓄积并迅速升温,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入气相,此时被分析物与基质分子一起被释放出来,在此过程中生物大分子与基质分子同时发生了质子转移,从而使生物大分子得到离子化。


        在MALDI—MS中关键是选择合适的基质,基质的具体作用包括:(1)生物大分子样品被基质分散,从而减小生物大分子间的相互作用;(2)基质从激光束中吸收能量并转化为固态熔体体系的激发能,使微量样品产生瞬间相变,并吸收过剩的能量;(3)使生物大分子离子化。


        MALDI产生的离子常用飞行时间(time—of—flight,TOF)检测器来检测,其原理是:待测物在离子源离子化后,离子在电场作用下加速,飞过自由漂移区后到达检测器,通过到达检测器的时间不同而得到检测。理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI—TOF质谱很适合对核酸等生物大分子的研究。


        生物质谱在核酸领域的应用


        生物质谱在单核苷酸多态性分析、甲基化分析、产前诊断、细菌检测、病毒分型等领域均有重要应用。提到病毒分型,那么质谱在最近的新冠有怎样的应用呢?


        疫情发生后,中国医学装备协会很快就发布了四批次的《新冠肺炎疫情防治急需医学装备目录》,从目录中可以看到,每批次都有质谱的身影。



(点击图片放大观看)


第一批



第二批



第三批



第四批


        国家卫生健康委临床检验中心于2020年3月16日~24 日开展了2019-nCoV 核酸检测室间质量评价,并将检测结果进行了统计分析:

(点击图片放大观看)

表. 各阳性样本不同方法检测结果符合率和复检率


表. 各阴性样本不同方法检测结果符合率和复检率


        由以上数据可以看出,相对来说应用质谱检测参与室间质评的实验室较少,但效果良好。由此也可以推测目前使用质谱检测新冠病毒的实验室不会太多,其原因可能是由于质谱方法没有被写入新冠检测指南,以及质谱仪器价格昂贵等。


        专家共识


        为了更好的规范和指导核酸质谱实验室,2018年3月27日,中国核酸质谱应用专家共识协助组在中华医学杂志上发表了《中国核酸质谱应用专家共识》。该指南共识主要是针对的是MALDI-TOF MS与多重PCR结合的检测方法。


(点击图片放大观看)



        共识中提到临床最为常用的SNP检测手段主要为Sanger测序、荧光定量PCR、低密度基因芯片和焦磷酸测序等,但是这些方法并不能完全适合多基因多位点的检测需求。相比之下,MALDI-TOF MS利用多重PCR技术,即1个反应管可同时检测多个SNP位点(最大可同时检测52个位点),可极大的提高多基因多位点的检测效率以及降低样本用量,满足临床新的需求。


        核酸质谱入列疾病预防控制中心建设标准


        2020年7月8日,国家卫健委根据住房城乡建设部《关于印发2015年建设标准编制项目计划的通知》(建标函〔2015〕273号)要求,组织开展了《疾病预防控制中心建设标准》编制工作,现已形成征求意见稿。



        在发布的疾控预防控制中心实验室主要仪器装备配备标准目录中,我们看到了很多质谱仪器的身影,包含微生物快速鉴定质谱仪、核酸质谱分析系统、气相色谱-质谱联用仪、气相色谱-高分辨质谱联用仪、二维气相色谱-质谱-质谱联用仪、液相色谱-质谱-质谱联用仪、液相色谱-质谱联用仪、液相色谱-高分辨质谱联用仪、电感耦合等离子体质谱仪等。其中的核酸质谱分析系统与微生物快速鉴定质谱仪是专用于微生物检测的


        小结


        在过去的几十年内,质谱技术取得非常大的突破,使其在生物大分子检测的应用成为可能,而各个公司开发多种高分辨、高灵敏度、高采样速度的质谱,并成功推广到各实验室,大大推动核酸的质谱研究,各研究机构和个人开发丰富的质谱研究方法和质谱研究工具,大大促进质谱在核酸领域的应用。但是,质谱技术也有一些不足之处,比如目前的研究都有各自不同的操作过程,在样本处理、质谱图采集和分析等方面没有统一的标准,可能会影响分析结果在实验室内和实验室间的可重复性; 标准的鉴定参考图谱数据库尚不够完善, 需要进一步拓展等。相信在未来几年里,随着问题的不断解决,核酸检测,尤其是转录组的研究,将得到突飞猛进的发展。


        引用


        [1] Saunus JM,Quinn MC,Patch AM.et al. Integrated genomic and transcriptomic analysis of human brain metastases identifies alterations of potential clinical significance[J]. J Pathol,2015,237(3):363-378.

        [2] Bustamante M,Matus JT,Riechmann JL. Genome-wide analyses for dissecting gene regulatory networks in the shoot apical meristem[J]. J Exp Bot,2016,67(6):1639-1648.

        [3] 张祥民,张丽华,张玉奎. 近年中国色谱研究进展[J]. 色谱,2012,30(3):222-231.

        [4]杨莹莹, 郑萍, 叶利明. 生物质谱技术及其在核酸领域的应用[J]. 药物分析杂志, 2008(04):642-646.

        [5]周江. 质谱技术在核酸研究领域的应用[J]. 中国科学:化学, 2014, 44(5).

        [6]李云峰, 马文晨, 方义亮, et al. 生物质谱技术在核酸检测中的应用[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2017(02):71-74.

        [7]李军. 生物质谱技术及其在RNA检测中的应用[J]. 现代仪器与医疗, 2009(05):21-26.


热门推荐
我要留言
*登录后留言!   会员请登录,不是会员请注册
客服

QQ客服:3602981236 (在线咨询)


工作日 : 9:00-22:00 
节假日 : 9:00-18:00


微信客服:LC-MS-MS (添加咨询)


工作日 : 9:00-22:00

节假日 : 9:00-18:00

微信
公众号

扫码关注公众号,了解更多

实用工具
有奖投稿