【冯仁丰】认识临床实验室的溯源性(7): 不同计量水平下的实现溯源性的过程(2）
发布日期：2019-11-11 来源：本站 浏览数：2235 人
本微信将继续向大家介绍ISO 17511的征求意见稿中，第二个计量溯源的情况。原先的ISO17511文件，将具有一级参考物质和检测程序的所有溯源情况，列为一个形式。但是在该征求意见稿中，列出了两个不同的情况。
在我的溯源性微信（6）中，叙述的溯源性情况是：被测量被定义的是完整的某个物质分子。但是在这篇微信中，尽管叙述的依然是具有一级参考物质和参考检测程序，可是能够确定的被测量只是某个被检测分析物中的一部分。可应用在被测量按照某程序确定的，检测的一个量是被测量的一个成分（如，一个多肽的片段或一个表位），而不是预期被检测的完整分子结构的量（如，血红蛋白A1c）。
这样的分类是以往所没有的。这也是这个征求意见稿中开创的一个分类。因此，我们检验同道要认真学习。请大家仔细阅读第5.2.1。
5 计量溯源性的校准转换方案的模式
5.2 具有一级参考物质和参考检测程序（具有由参考检测程序定义的被测量，和计量溯源性到SI）的情况（见图2）
图2 校准层次- 由较高等级的参考程序和一级参考物质确定被测量；可溯源至SI
5.2.1 这个情况可应用在被测量按照某程序确定的，检测的一个量是被测量的一个成分（如，一个多肽的片段或一个表位），而不是预期被检测的完整分子结构的量（如，血红蛋白A1c）。在给定的校准层次中提供可计量溯源性到SI，按照图2中的方案，若相应的话，以下的概念应考虑在指示的步骤中：
5.2.1.2 因某个特定的表位或特定结构，是被测量的一部分，参考检测程序(p.2)应确定被测量。
注1：所以非常重要的是，为给定校准品设定值的检测程序得到的值（如，在对物质（校准品）m.2定值时的程序p.2,），和以后的（下一个较低等级）检测程序（如，p.3）用于为下一个较低校准品水平（如，m.3）设定值相关良好（即，校准品m.2需要与病人样品是互换的，用于设定它的值的初始检测程序、以及以后的检测程序为预期被用作校准品的二者）。否则通过校准层次将会引入偏移。
注2：作为最高等级的一级参考物质(m.1)，不可以传统的手段评估互换性。特别在水平p.1和p.2处，但是也会在选定校准层次的较低水平是一个因素。要求充分理解偏移和影响量的潜在来源。无论是否可用，推荐使用正交直线方法，即依据不同原理的方法和提供关于被测量的不同信息。
示例：以均相免疫检测方法对C-反应蛋白（CRP）的定量检测，严重地依赖于分析物的低聚物的状态。依据检出某个选定的CRP-导出的多肽的一个约定参考方法，它对CRP的低聚物状态是盲目的。这里必须使用正交方法去排除在制备某个CRP二级参考物质的偏移，协助确保在CRP参考物质制品中，有一个可接受比例的单体部分。如果选定的约定参考检测程序是依据免疫化学方法的，在一级参考物质和校准品内的单体部分，应是独立地确定（以其他方法），去排除偏移，作为以病人样品制备参考物质内的蛋白低聚物状态中差异的函数。
5.2.1.3 对于一级参考物质(m.1)（特别作为CRM提供的）的值的设定和文件，应符合ISO 15194的要求。
5.2.1.4 应可制备一级校准品(m.1)或由一级参考程序设定值。
注1：经常这是一个称量容量法的制备程序，对一级参考物质先称量、再以相应溶剂配制在容量瓶内。
注2：一级校准品(m.1)，可以是具有基质的物质，类似于预期被终点用户常规检测程序检测的人原始样品的基质。
5.2.1.5 较高等级的参考检测程序(p.2)应被用于为某个具有基质的二级校准品设定值。
注：这样的二级参考物质将一般具有类似于被终点用户的常规检测程序检测的人原始样品的基质，以确保在检测程序中它们是可互换的，它们将校准如p.3和/或p.4。
5.2.1.6 厂商选定的检测程序(p.3)应确定一个检测系统，若可用，由一个或多个一级或二级校准品校准。
注：一个厂商的选定的检测程序(p.3)可以是与参考检测程序(p.2)相同。
5.2.1.7 厂商工作校准品(m.3)应具有按照厂商选定的检测程序设定它的值。这个校准品有时被称为“厂商”的一级（master）校准品（或“内部校准品”）。该校准物质(m.3)应已经证明厂商的选定检测程序和被校准的程序(p.4)的互换性。
注：一个厂商的工作校准品(m.3)可以是，如具有类似于在终点用户的常规检测程序检测的人原始样品内的基质。
注意呀
下面还有一段也是5.2.1.7！
5.2.1.7 厂商常设的检测程序(p.4)应确定某检测程序被一个或更多的厂商的校准品(m.3)、或较高类型的校准品校准，并确认了分析的特异性。
注1：厂商常设的检测程序可以依据如常规检测程序的相同的原理和方法，但是应具有较低的检测不确定度，通过如较多次数的重复检测和较严厉的控制系统获取。
注2：厂商的产品校准品可以是，如具有类似于在终点用户的常规检测程序检测的人原始样品内的基质。
5.2.1.8 终点用户的常规检测程序(p.5)应叙述一个经常由厂商提供的检测系统，由一个或多个厂商的产品校准品校准。
5.2.1.9 若取消了某个校准层次的水平（一个校准品和程序对），可减少不确定度。见第5.1.3节限定。
我的理解和解释：
我特别关注这个溯源链中，将被测量的定义置于p.2程序。按照本节前面叙述的：
5.2.1 这个情况可应用在被测量按照某程序确定的，检测的一个量是被测量的一个成分（如，一个多肽的片段或一个表位），而不是预期被检测的完整分子结构的量（如，血红蛋白A1c）。在给定的校准层次中提供可计量溯源性到SI，按照图2中的方案，若相应的话，以下的概念应考虑在指示的步骤中：
我们是否已经遇到过这样的情况？我回忆起在上世纪的90年代，由于心肌梗死诊断的紧要和迫切性，使用肌钙蛋白对疑似心肌梗死病人的检测是当今的主要项目。因为cTnT被Roche（原Bergmeyer）公司专利垄断，其他公司只能开发cTnI项目。各个公司的cTnI产品对病人样品检测结果间，结果无可比性，差异可达百倍！一直认为，国际上缺少肌钙蛋白参考物质，才是可比性差的主要关键。
美国标准和检测研究院（NIST）从人心中提取和纯化了人心肌肌钙蛋白。与2006年发布，该标准物质的标准号为SRM 2921。当时，立即使用该标准物质到各个公司的肌钙蛋白的产品中。但是检测结果令人失望。该标准物质和6个cTnI阳性人混合血清发送给15个cTnI厂商。结果甚至比采用混合血清作为一个临时校准品的离散程度还要差。cTnI无可比性的真实原因何在？经过研究，了解了血液中，存在的cTnI是一个具有不同分子类型的非均相混合物。因为其非均相性引出的分析问题，是各公司产品检测结果不一致的主要原因。若能识别混合物中一个共有的、分子的一致的不变部分，那么也许能克服检测不一致性。用于形成cTnI检测的抗体，应被选择地识别这个不变异部分内的决定簇，才可导致免疫检测反应性均一性随之而来的增加。
因此，肌钙蛋白标准化工作组强烈建议，所有具有cTnI产品的公司，若能使用完全相同的单克隆抗体，cTnI检测结果的一致性方可实现。另外，很快被大家了解了，SRM2921与新鲜人血清间不具有互换性。尽管当时在该物质研制时，很多有识之士已经提醒了，在证实肌钙蛋白标准物质发布前，务必注意标准化物质与人血清间的互换性。可惜，急于发布却忘怀了与人血清间的互换性。
这个示例，可以作为这个溯源性做法的非常好的例子。当然，至今关于cTnI的标准化还没有完成，除了需要一个标准物质、需要注意与人血清间的互换性外，还有许多问题。当然，至今，还没有一个检测分析物或被测量，在各个公司的产品上，为了达到一致性使用了相同的单克隆抗体。征求意见稿中，举了C-反应蛋白（CRP）的示例。
1989年国际临床化学和检验医学协会（IFCC）开始对人血清蛋白的含有基质的参考物质的处理、确认、和定值。1993年，共同体的参考局发布了CRM 470（以后被重新评价和命名为ERM-DA470），被确认为14种蛋白的参考物质。对ERM-DA470内CRP定值的蛋白浓度，采用了1stInternational Standard CRP 85/506校准的测量。由于CRM470已经为多个特定蛋白的标准化服务了近20年。确实使这些项目的检测结果在全世界范围内的可比性有了实在的进步。
但是，2008年颁布的多种蛋白参考物质怎么将原来的CRM-470成为ERM-DA472/IFCC、和ERM-472k/IFCC？究竟为什么？
2008年报告以ERM-DA472k/IFCC（可从IRMM获取）取代了ERM-DA470的12种其他蛋白，它不适用于CRP，因为冻干过程使CRP的值出现偏移。ERM-DA470（原CRM470）参考物质的冷冻干燥和以后的复溶，对CRP的回收不佳，该蛋白使用了两个市售方法做了检测。若在冷冻干燥前添加钙，可以缓解CRP回收率的下降。但是，在最后的ERM-DA470k/IFCC中没有这么做，因为钙对稳定性和其他蛋白的互换性的影响尚未可知。最后，为了提供一个对CRP最佳的条件，将物质分开进行液体冰冻保存（ERM-DA472/IFCC）。
研究中观察到的CRP问题：冷冻干燥后的回收率仅75%；在冷冻干燥的材料中瓶间的非均相性高；由于在冷冻干燥的材料中存在CRP不同的低聚物。这些CRP低聚物不能被临床实验室使用的一般免疫检测方法检测出来。校准的过程会因低聚物状态而变化，将中止溯源性链。因此，在制备第二批参考物质时，为防止CRP在冷冻干燥的加工过程中出现低聚表现，专门取出一部分制品的液体深低温保存，用作CRP的参考物质，给出的参考物质代号为ERM-DA472/IFCC。
因此，在溯源性图示中，m.1为CRP专用的ERM-DA472/IFCC。p.2为国际认可的参考实验室，采用了确保CRP检测可靠的检测程序p.2，为m.2物质（即一组人的临床标本）检测，给出CRP的可靠结果。接着，厂商从参考实验室那里，拿到了具有CRP定值结果的一组人临床标本m.2。然后在公司内部，以m.2校准公司的常设检测程序p.3，实际上是进行了p.2和m.2组合，与p.3和m.3的组合，对一组病人标本的检测比较，在比较中调整了m.3的定值。由此，将CRP的可靠结果传递给了m.3。
（待续）
来源：微信公众号“冯仁丰”
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