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样品前处理 | 质谱检测前处理技术之“SPE固相萃取篇”
发布日期:2018-09-23   来源:大Q 临床质谱网   浏览数:3459

  



近年来,高灵敏度、高效率、特异性强的质谱检测技术在临床相关领域的应用越来越广泛,许多检测机构应运而生,国内的各大医院也开始慢慢了解并陆续引入质谱技术在临床上开展一系列检测项目和科研应用。

虽然质谱检测技术有诸多优势,但临床上血液等生物样本却不能直接送入质谱进行分析,而必须要经过一系列的样品前处理流程(如蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等),以达到净化或纯化样品,降低基质干扰,提升灵敏度和准确性的目的。

作为实验猿一枚,大Q经常需要去客户端帮客户解决临床检测项目开发过程中遇到的一些问题。交流过程中发现好多客户对SPE前处理相关技术依然存在较多困惑和疑问。因此,借助“临床质谱检测”公众号平台,这里把SPE样品前处理技术原理、操作步骤、填料类型系统介绍下,供业内同行交流学习。

所谓固相萃取(Solid-Phase Extraction,SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术,由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来,主要用于样品的分离、纯化和浓缩。与传统的液液萃取法相比,可以提高分析物的回收率,更有效的将分析物与干扰组分分离,减少样品预处理过程,操作简单、省时、省力。液液萃取主要还是做一些弱极性或非极性的目标物,对那些极性过强或者离子型目标物并不适用,而且没有除杂过程,处理后的样本会含有非极性的杂质,不但会污染色谱柱和仪器,也会造成一定的基质效应。固相萃取理论上非极性、极性、离子型目标物都可以适用,这也是近年来固相萃取技术越来越流行的原因。由于临床上样本量大,报告周期短,为了更好的提高通量和效率,很多实验室会把96孔萃取板作为固相萃取作的首选。

SPE固相萃取按照保留物质分为类:一类为保留目标化合物;另一类为保留杂质(类似QuEChERS的前处理操作)。SPE固相萃取按照填料类型分为三类:非极性保留型;极性保留型;离子交换型。

大Q这里以保留目标物的固相萃取为主进行讲解,因为保留杂质的方法操作简单,理解起来也比较容易;保留目标物的方法操作起来相对复杂,理解起来会有一些困难,如果不明白每步的意义,是很难建立一个能满足检测要求的前处理方法的。大多数固相萃取基本操作步骤是由下图所示四个环节完成的。


其实基本的操作步骤,常用到固相萃取的技术人员应该都耳熟能详。但是每步的原理与意义不知大家是否清楚呢?



第一步:活化

SPE一般是用一定体积的有机试剂和一定体积的水溶性试剂进行分步过柱来实现活化过程。活化有如下2个目的:
1. 通过有机试剂和水溶性试剂过柱来去除小柱中自带的一些杂质,避免系统污染和对上样效果的影响。
2. 使填料表面的官能团更有序的舒展开,为后面的上样液增大接触面积,起到更好保留的作用。


这个可能比较抽象,理解起来会有点麻烦。大家可以看下面的活化前后对比图就一目了然了:     

活化之前高聚物的结构排布是不规则的,很多结构都是像“毛线团”一样紧紧抱在一起的。这就会造成很多官能团被包裹在“线团”里面,起不到很好的与目标物接触并起到保留作用。所以活化后这些结构排布就会变得非常有秩序,增大了与目标物的接触面积,也就会很好的保留住目标物了。




第二步:上样

经过活化后,我们就可以把经过预处理(如稀释、蛋白沉淀等)的样本进行上样操作了。上样后目标物就会牢牢的被保留在SPE填料上,当然也会有一些性质和目标物类似的杂质被保留在SPE上。其余的杂质就会直接随着上样液流出来。





第三步:淋洗


淋洗的目的就顾名思义了,就是把杂质淋洗下来,避免对色谱柱和仪器的污染,也会减少杂质对目标物检测的干扰,这个减少干扰也就是所谓的减少基质效应。

第四步:洗脱

洗脱就是用试剂来破坏目标物与填料间的作用力,从而将目标物从填料上分离并收集起来。



第五步:氮吹复溶

此过程为可选步骤,通常有两种情况会需要氮吹复溶操作。一是洗脱液与初始流动相差别较大,如果直接进样的话可能会出现严重的溶剂效应,影响峰型,因此需要氮吹挥干后用初始流动相复溶后进样分析。二是仪器检测的灵敏度达不到实际样品分析要求时,可氮吹挥干后用小体积复溶液复溶,增大目标物浓度后再进样分析。



根据不同目标物,需选择不同SPE来匹配。例如离子型目标物,要选择离子型SPE。为了更好的保留住目标物,弱电离的目标物要选择强离子交换型SPE,强电离的目标物要选择弱离子交换型SPE。其实大家记住口诀就好了— — 强对弱,弱对强!如果强强结合的话,目标物就被牢牢的保留在固定相上了,是很难再被洗脱下来的。由于市面上不同厂家填料有很多类似之处,因此下面我们列举部分填料为例,给大家介绍下SPE的种类及原理。

1、高聚物强阳离子交换型
  


高聚物强阳离子交换填料实际上是在苯环上键合了磺酸基团,这是个强电离的负离子基团,强对弱!所以主要应用的是弱阳离子目标物。原理很简单,就是强阴离子吸附弱阳离子!

2、高聚物强阴离子交换型


高聚物强阴离子交换填料就是在苯环上键合了季氨基团,由于强对弱!所以主要适用于弱阴离子目标物。原理就是强阳离子吸附弱阴离子。

3、弱阳离子交换和弱阴离子交换型
 

弱离子交换填料只是多键合了极性官能团,目的是通过极性作用力来确保对一些极性目标化合物也有更加均衡的保留。弱阳离子交换临床上可用于血液或尿液儿茶酚胺及变肾上腺素类物质样品前处理。

4、非极性保留型


如高聚物填料,也就是聚苯乙烯二乙烯基苯,没有进行键合的填料。主要作用力为分子间作用力,也就是非极性保留。临床上可用于血液脂溶性维生素ADEK、血管紧张肽类物质样品前处理。



小结



善于观察的朋友可能会发现高聚物的基本架构比较类似,其实都是以聚苯乙烯二乙烯基苯为骨架进行键合的。聚苯乙烯基二乙烯基苯主要是非极性作用力,适用于非极性目标物;键合的极性官能团主要是极性作用力,用于保留极性目标物;键合的强弱离子基团,通过离子作用力来保留离子型目标物。其初衷或许是为了设计一款通用型的填料吧。

其实市面上除了以上介绍的高聚物填料外,还有一种硅胶基质的填料。硅胶基质的填料分为离子交换型和纯硅胶型,原理和聚合物填料基本一致,不过硅胶没有非极性作用力,所以不适用于非极性目标物的保留萃取。这两类填料在前处理步骤上还是有一些差别的,包括交换容量也是不一样的。

介绍太多怕看官们感到疲惫,大Q有时间会写写有关前处理方法操作和方法开发心得,到时候再和大家慢慢介绍。如果大家有任何疑问或者不同见解可以在公众号下方或者后台留言。大Q也很高兴和大家交流和学习来提高自己的知识储备。

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