液相色谱-串联质谱法临床样品前处理专家共识发布！
发布日期：2024-01-24 来源：中华预防医学杂志2023年12月第57卷第12期 Chin J Prev Med, December 2023, Vol. 57, No. 12 浏览数：1878 人
摘要
液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）集色谱技术的高分离能力和质谱技术的高选择性、高特异性及高灵敏性的优点于一体，成为临床检验领域最具有生命力的新技术之一，但其分析效果往往受待测样品特性制约。由于质谱仪的抗干扰能力有限，生物样本多需要进行合适的样品前处理才能有效提高检测性能，实现精准检测。前处理的主要作用是将目标分析物从生物基质中有选择性地分离出来，减少其他基质组分的干扰。同时，还可将目标分析物浓缩和富集，提高检测灵敏度。目前，临床样本前处理方法不仅种类多，个别方法耗时繁琐，给实验室人员在方法选择和开发及标准化操作等方面带来了困难。因此，本共识旨在为实验室方法建立提供指导，助力临床质谱检测方法的研发规范发展。
近年来，各种检验新理论和新技术不断涌现，极大地推动了临床检验学科的发展。液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）集色谱技术的高分离能力和质谱技术的高选择性、高特异性及高灵敏性的优点于一体，有效避免了免疫法的非特异性干扰等缺陷，日益受到国内外临床检验界的青睐，成为临床检验领域最具有生命力的新技术之一 [1,2,3]。LC-MS/MS广泛应用于小分子化合物的定性与定量检测，对于LC-MS/MS而言，生物样品的前处理是十分必要的。样品前处理旨在从复杂的生物基质中提取小分子目标分析物，去除生物基质中的大分子、盐、脂类以及其他杂质，减少目标分析物在质谱上受到的基质效应以及其他物质的干扰。首先，由于人体血液样品不易获得，所以要求取样量尽量少，同时应尽量避免由样品前处理不当导致的重新取样；其次，多数小分子化合物在人体的含量较低，一般在pg/ml至ng/ml水平，且生物样本基质复杂，内源性干扰物较多，质谱分析前需要尽可能纯化样品[4]；另外，质谱仪本身的耐污染能力较低，要求进样引入的干扰物尽量少。杂质和干扰越少，离子源沉积污染物越少，离子化效率更稳定，质谱响应更高，信号更稳定。
一、样品前处理方法概述
按照原理不同，样品前处理方法可分为稀释法、蛋白沉淀法、萃取法、超滤浓缩法、免疫亲和提取等。按照目标分析物在样品前处理过程中是否发生化学修饰，可分为衍生法和非衍生法[6 , 7] 。
目前LC-MS/MS项目包括内源性小分子化合物（如维生素、激素、儿茶酚胺及其代谢物、氨基酸、胆汁酸等），外源性的小分子化合物（如临床药物、鼠药、农药等）以及部分多肽和蛋白类标志物（未包含蛋白质酶解等特殊前处理方法）的定性或定量分析[8 , 9 , 10 , 11 , 12 ]。
样品前处理方法的选择应综合考虑目标分析物的浓度水平、理化性质、样品的基质类型、仪器的灵敏度和抗干扰能力等实际情况。
三、样本前处理的关键要素
“人机料法环”是对全面质量管理理论中的5个影响产品质量的主要因素的简称，这5个环节也是临床液相色谱-串联质谱法临床样品前处理的关键要素。只有把控好这5个环节，才能确保临床检验的真实性、准确性和可靠性。
（一）人：样品前处理对人员的要求
技术人员宜具备临床检验、分析化学、药物分析专业知识或质谱应用等经验、或受过相关培训等经历，了解目标分析物的化学性质以及需熟练掌握色谱、质谱技术理论、仪器设备使用维护、检验项目标准操作规程、质量控制方法、化学品尤其是危化品管理等相关知识，技术人员须进行岗前培训及考核，考核通过后方可上岗 ［ 13 ］ 。
建议1：样品前处理技术人员应经过色谱质谱原理、分析化学和药物分析专业知识、仪器使用及维护、检测项目、标准操作程序（standard operating procedure，SOP）等专项培训，考核合格方可上岗。
（二）机：仪器特点及分类
1.质谱仪样品前处理方法选择与仪器的灵敏度有关。本共识按照LC-MS/MS检测灵敏度由低到高分为三类仪器：Ⅰ仪器、Ⅱ仪器、Ⅲ仪器。例如，柱上进样利血平标样，Ⅰ仪器的最低检测限大于20 fg；Ⅱ仪器的最低检测限介于1 fg~20 fg；Ⅲ仪器的最低检测限小于1 fg。
Ⅰ仪器的样品前处理方式较为复杂，相比于Ⅰ仪器，Ⅲ仪器或可使用更简便的样品前处理方法即可满足要求。临床常见LC-MS/MS检测项目推荐的样品前处理方法及质谱仪要求见表1 。
表1 常见临床LC-MS/MS检测项目推荐的样品前处理方法及质谱仪灵敏度要求
2.辅助设备
（1）移液器：校准合格的移液器。
（2）振荡器：管式振荡器，板式振荡器。
（3）离心机：高速制冷离心机、板式制冷离心机，离心机应校准合格。建议使用中等及以上的离心力（如2 500× g/3 000× g），并根据项目特点选择离心温度，有利于实现较好的离心效果。
（4）氮吹装置：根据检测项目前处理需求，配备多孔氮吹仪，连接氮气（空气）源，以达到挥发溶剂、浓缩和提纯样品的目的。建议将氮吹装置放于通风橱中，避免操作过程中可能存在的挥发性气体损害风险。氮气源可为氮气罐或质谱配套的氮气发生器中接出的氮气。
（5）正/负压装置：正压装置配备氮气（空气）源，负压装置配备真空泵。
（6）移液工作站。
（7）含磁吸模块的提取设备。
（8）其他。
建议3：实验室应根据待测物的理化性质、生理水平、检测精密度、灵敏度等要求，选择合适的前处理方式和检测仪器，实现可接受的性能要求和临床预期用途。
（三）料：样品前处理相关试剂与辅助耗材重点要求
1.试剂
临床LC-MS/MS前处理常用试剂见 表2 。
表2 临床LC-MS/MS前处理常用试剂
（1）容器：塑料离心管、96孔深孔板、上样板、进样瓶。
（2）过滤耗材：0.22 μm亲水性聚四氟乙烯滤膜（polytetrafluoroethylene，PTFE）、0.22 μm亲脂性聚四氟乙烯滤膜、蛋白沉淀板。
（3）萃取板：固相支撑液液萃取板（supported liquid extraction，SLE）、固相萃取板或固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）。
常见前处理方法及所需主要设备和耗材见 表3 。
表3 常见前处理方法及所需主要设备和耗材
3.样品采集活动的指导
实验室应制定采集和处理原始样品的程序，规定不同检测项目所需的样品类型、样品体积、采集器械、保存剂及保存时间的要求，应向样品采集者提供相关信息和指导。临床质谱常见检验项目的样本类型及保存条件见 表4 ，表中保存条件所列时间为常见保存时间，个别项目可能不稳定，实验室需进行检测项目稳定性的考察以确定最终添加剂和保存条件，如尿儿茶酚胺多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素的样本在室温24 h内或4 ℃下5 d内可优先选择硼酸（10 g/2 L尿液）进行防腐；50%乙酸（25 ml/2 L尿液）进行防腐时则需在4 ℃下3 d内完成；尿儿茶酚胺中甲氧基肾上腺素类物质样本优先选择硼酸（10 g/2 L尿液）或50%乙酸（25 ml/2 L尿液）进行防腐；未添加防腐剂时4 ℃ 3 d内完成。
表4 常见检测项目样本类型及保存条件表
1.稀释法（dilution method，DM）
原理：采用与LC-MS/MS兼容的样品稀释溶剂对样品进行稀释。
稀释法是最简单的样品前处理方法，兼容性比较强，目标分析物回收率高，具有操作简单快速、样本完整性好、成本低等优点，缺点是选择性差。稀释法仅适用于基质效应小，浓度较高的目标分析物，且样品中不含或仅含很少大分子的简单液体基质，如尿液、泪液、脑脊液等。具体应用实例见 附录B.1 。
建议5：待测物浓度高且基质成分简单的体液样本（尿液、泪液、脑脊液等）推荐采用稀释法。
2.蛋白沉淀法（protein precipitation，PP）
原理：使用物理、化学、生物等手段使蛋白质凝结成块。蛋白质沉淀常用的方法有以下几种 ［ 14 ］ ：
（1）有机试剂：改变蛋白质分子间的氢键，形成蛋白沉淀。
（2）中性高浓度盐：使蛋白脱水形成沉淀。
（3）酸：在pH值低于蛋白质的等电点时，强酸与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。
（4）部分金属盐：金属离子与蛋白质的羧基形成不溶性的盐沉淀。
蛋白沉淀法是简单、快速和应用最广泛的生物样品前处理方法。生物样品如血清、血浆和全血中含有丰富的可溶性蛋白，在样品分析测定之前，首先必须去蛋白。许多方法可使蛋白质变性，常见的蛋白沉淀剂以及用量详见 表5 。
表5 常见蛋白沉淀剂类型及沉淀剂和样品比例
建议6：对于含有丰富可溶性蛋白的血清、血浆和全血样本，测定小分子化合物时推荐采用蛋白沉淀法。推荐采用酸、金属盐、有机溶剂等作为沉淀剂与样本按一定比例混合，涡旋混匀，离心取上清后上机检测。
3.萃取法（extraction method，EM）
（1）常规萃取法（routine extraction，RE）原理：采用目标分析物易溶解的试剂浸泡干血斑，从而使干血斑中的目标分析物被萃取至试剂中。
干血斑（dried blood spot，DBS）是多年来临床中常用的样品采集技术，业界对DBS技术的关注度也越来越高。它除了具有样品体积小，容易采集、储存、运输等优点外，还能够有效提高样本储存稳定性。DBS样品常用的前处理方法为有机溶剂萃取，其操作简单、快速、易于全自动化。具体应用实例见 附录B.3 。
（2）液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）原理：基于目标分析物在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同而进行分离或提取，临床检测项目通常将化合物从水相中萃取至与水不相溶的溶剂中。
LLE是生物分析中最常用的样品前处理技术之一，其灵活度高，对提取溶剂类型、pH、离子强度均可选择，具有选择性相对较高、成本低、可浓缩目标分析物等优点。但也存在不足，该方法不适用于亲水性化合物；如果多个目标分析物具有不同的亲脂性，LLE开发难度较大；该方法操作较繁琐，不易实现全自动化；重现性较差等。常用的萃取剂有甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷，或者一定比例的混合溶剂。LLE方法的开发需要根据目标分析物的极性和溶解度选用合适的萃取剂，改变有机试剂，调节pH或者缓冲溶液的离子强度，可以有效地将目标化合物从水相萃取至有机相中，将基质中的其他成分留在水相中。具体应用实例见 附录B.4 。（3）固液支撑萃取法（supported liquid extraction，SLE）原理：目标分析物在有机试剂和吸附于固体载体上的水相之间的分配平衡。
利用高表面积的惰性固体来提高水溶性样品与萃取剂（水不相溶有机试剂）之间的接触面。常用的萃取剂包括：MTBE、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或者两种溶剂的混合。生物样品上样后，加入萃取试剂，从固体载体表面萃取目标分析物。SLE可借助96孔板实现高通量，且不会形成乳化液，目标分析物的提取效率有所提高，更便于自动化。具体应用实例见 附录B.5 。
（4）固相萃取法（solid phase extraction，SPE）原理：与液相色谱分离原理基本相同，即基于样品基质各种组分在固定相和流动相两相之中的分配系数不同，使目标分析物与基质中的干扰物质分离并洗脱下来，同时浓缩目标分析物。
SPE小柱根据填料不同实现不同的分离模式（正相、反相、离子交换等）选择性保留目标分析物而使干扰物流出，从而达到样品净化的目的。表6 列出了常见的SPE类型、保留和洗脱机制及应用。根据样品前处理目的不同，SPE可实现除杂、脱盐、使复杂样品得到净化，同时能浓缩目标分析物，提高灵敏度。SPE具有从中等到高等的选择性；并有良好的重现性；经过SPE样品前处理，能够降低目标分析物的基质效应；可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度。但是SPE成本高，操作步骤繁琐，且需要复杂的正压或者负压装置，SPE小柱或SPE板易出现液体滴落不均匀，筛板堵塞等现象。
表6 SPE类型、保留机制和应用
常见SPE流程表参见 表7 。具体应用实例见 附录B.6 。
表7 常见SPE操作流程
4.磁珠法（magnetic bead extraction，MBE）
磁珠法是近两年涌现出来的新技术，其主要原理是在磁性材料表面包被固定相，在固定相上进行相应的官能团修饰，根据磁珠抓取物质的类别分为两类：一类为吸附目标分析物的磁珠，称为富集磁珠；一类为吸附样品中的杂质的磁珠，称为净化磁珠。净化磁珠的原理为磁珠与蛋白沉淀物理结合以及静电吸附和配位结合，从而达到净化样品的作用。富集磁珠的原理同SPE方法相同，但与SPE相比，灵活度更高，成本较低，解决了SPE筛板堵塞的问题，其操作简单，可实现全自动化。磁珠法的出现，大大推动了临床质谱前处理的自动化进程。具体应用实例见 附录B.7 。
建议8：对于有磁珠法试剂盒的检测项目而言，建议在经过实验室性能验证合格后采用。搭配全自动样本前处理系统，将极大地提高样本前处理的自动化水平。
5.超滤法（ultrafiltration，UF）
原理：使用滤膜过滤器或超滤离心管等装置，利用过滤拦截的原理，根据分子大小，选择性保留或者滤过溶液中的成分。
超滤也可用于生物大分子的浓缩、纯化、脱盐等。超滤适合游离型（非结合）的小分子目标化合物的分析，但超滤法成本相对较高。超滤应保持一定的速率，超滤过程中，通过膜的游离部分从样品中除去，导致蛋白结合部位积累，打破了最初的蛋白结合平衡，导致进一步的解离，建立新的平衡。因此应当控制超滤的速率和时间。另外，超滤过程中，建议采用生理条件（37 ℃、pH值7.4）和低至中等的离心力。超滤膜的孔径应该低于结合目标化合物的蛋白质的分子量，孔径过大则杂质过高，不能充分分离，孔径过小则有效成分通透率较低，损失较大。具体应用实例见 附录B.8 。
建议9：在使用超滤法时，应注意超滤的速率。超滤膜的孔径应该低于结合目标化合物的蛋白质的分子量，孔径过大则杂质过高，不能充分分离，孔径过小则有效成分通透率较低，损失较大。超滤过程中，另外，应控制超滤的条件和时间，如生理条件（37 ℃、pH 7.4）和低至中等的离心力。
6.平衡透析（equilibrium dialysis，ED）
原理：平衡透析是一种浓度驱动的分离技术。该技术允许低分子量溶质通过合成聚合物或纤维素制成的半透膜从高分子中扩散分离出来。在透析过程中，要求使用生化成分尽可能接近血清/血浆离子环境的透析缓冲液；透析前将样品缓冲至pH值为7.4，温度为37 ℃，半透膜血清侧游离激素与膜缓冲侧激素之间形成浓度梯度，最终达到平衡。以游离甲状腺素为例，已有研究表明，结合甲状腺素和游离甲状腺素之间的平衡取决于温度和pH。当温度从20 ℃升高到37 ℃时，FT4的浓度增加一倍，因此如果真实反映体内FT4浓度，则应在37 ℃时进行。当pH与7.4每相差0.1，则FT4测量浓度偏差3%~5%。具体应用实例见 附录B.9 。
建议10：PH值和温度对于结合态激素和游离激素的平衡至关重要，应在合适的pH值和温度下进行透析操作。建议使用生化成分尽可能与血清/血浆离子环境接近的透析缓冲液。实验室应控制适当的缓冲液条件（如37 ℃、pH 7.4）。
7.免疫亲和提取（immunoaffinity extraction，IAE）
原理：免疫亲和提取利用抗原和抗体间特异性分子识别的原理，使目标分析物得到富集。
免疫亲和提取可提高LC-MS/MS方法的检测灵敏度和特异性，其检测下限可达到pg/ml的水平。但目前多数待测物缺乏商业化的、针对性的抗体，成本较高。具体应用实例见 附录B.10 。质谱前处理中不同方法适用样品类型及优缺点汇总见 表8 。
表8 质谱前处理中不同方法适用样品类型及优缺点汇总
8.衍生法（derivatization method，DM）
原理：衍生化技术是通过化学反应将样品中难以分析检测的目标化合物定量的转化成另一易于分析检测的化合物，通过后者的分析检测可以对目标化合物进行定性和（或）定量分析。衍生化的目的包括改善离子化效率，从而提高质谱检测的灵敏度；改善分离度，提升化合物在色谱上的保留能力；增强化合物的稳定性等。具体应用实例见 附录B.11 。常见的衍生化试剂及衍生产物见 表9 ，衍生化与非衍生化的对比见 表10 。
表9 常见衍生化试剂和衍生化反应
（五）环：样品前处理对环境的要求
前处理操作应在单独的区域进行，在样品前处理区配备足够的通风设施，必要时实施安全风险评估。前处理过程中可能涉及到易挥发性的试剂（如甲醇、乙腈、正己烷、挥发性无机酸等）的操作时，应在通风橱中完成。因外，充分考虑不同操作步骤可能存在的挥发性气体损害风险，还应配备万向排风罩等通风设备，以保障实验室人员安全 ［ 13 ］ 。实验室工作人员在操作过程中应根据情况佩戴口罩、帽子和手套等。见光易分解的物质，实验操作间应具备避光条件。应配备消防器材、冲淋装置、洗眼装置以及急救箱等应急装备。送检样本如不能立刻处理，应根据样本类型和各项目的检测需求，保存样本。如部分检测项目需要避光保存（如维生素）；常温保存（如肾素浓度 ［ 15 ］ ）；冷藏保存（儿茶酚胺）；血浆样本如不能立刻检测，建议分装保存，避免溶血。
建议13：实验室应注意前处理过程可能产生的挥发性气体、发热、噪音等污染，配备良好的通风、散热或者隔音设备。有条件的实验室可以设置独立的前处理区域，与仪器区分离开，降低对其他仪器和人员的干扰。实验室应对环境中影响检测结果的微生物污染、灰尘、电磁干扰、湿度、供电、温度、声音和振动等进行评估并设定相应要求。
四、操作时重点注意事项和常见错误
（一）内标的加入：前处理前即加入同位素内标并充分平衡待测物和内标，用于校正样本提取、HPLC进样、质谱离子化和检测中产生误差。
（二）样本离心：样本离心前保存温度过高或离心力过大，导致样本溶血或者破碎。
（三）抗凝剂：对于加入抗凝剂的样本需要及时摇匀，防止出现血凝块。
（四）样本类型：血浆样本的项目要选择合适的抗凝剂，减少凝血形成；血清样本应评价分离胶是否对待测物检测有影响。
（五）震荡和离心：样本前处理操作需要控制震荡力度、离心力、离心时间等条件。
（六）环境温度及避光：对于特殊项目，需要控制样本前处理的环境温度及光照条件等。
（七）样本储存：实验室应评估检测项目的稳定性，及时对样品进行检测，未能及时检测的样品应储存在适宜的温度、湿度、避光等条件下。
五、样本前处理的评价
选择一种合适的前处理方法，就等于完成了分析工作的一半。然而并没有一种前处理方法能适用于不同的待测物和不同的样本类型。即使相同的待测物，不同的样本类型，可能要采用不同的前处理方法。评价样本前处理方法是否合理，必须考虑以下方面 ［ 16 ］ ：
（一）待测物的提取效率：样本前处理方法提取率的高低，影响方法的灵敏度。
（二）待测物的基质效应：样本前处理，是否能有效的去除影响检测的干扰物，减少样本的基质效应。
（三）待测物提取过程精密度：样本前处理提取过程的精密度，直接影响检测的灵敏度及准确度。
（四）前处理的复杂程度：操作是否简单、省时，前处理越复杂，步骤越多，待测物的损失越大，误差也会越大。
（五）成本：在可满足临床检测要求的前提下，尽量避免昂贵的仪器和试剂。
六、自动化发展
近年来，临床质谱实验室自动化发展迅速，尤其是样品前处理的自动化。自动化样品前处理设备的使用，可以显著降低手工操作的误差、提升分析精密度，还可以降低技术人员劳动强度，提升整体检测效率。目前临床质谱的自动化尚处于起步阶段，国内企业和临床实验室 ［ 17 ］ 在样品制备自动化方面的探索主要是半自动化或移液工作站的解决方案，尚未有全流程的自动化、信息化和集成化的质谱检测系统在临床上应用。半自动化的前处理设备，一般体积小，重量轻，占地面积小，成本相对较低，但是需要人为的干预相对比较多。国外大型仪器制造商开发了全自动前处理系统，如近期日本岛津公司研发的全自动前处理系统CLAM TM-2030，可以自动完成血清样本的去蛋白和衍生过程 ［ 18 ］ 。移液工作站一般体积较大，成本相对较高，人工干预比较少，对实验人员的要求比较低，投入相对较高。
随着LC-MS/MS检测技术在临床逐渐被重视和认可，有关的科学技术研究也正在飞速进步，最终将逐步满足临床自动化和高通量的需求，提高对于临床实验室的适用性。目前，临床实验室可根据检测项目的前处理需求、样本量和经济成本等因素选择合适的前处理设备，配备自动化前处理设备，以方便样品的前处理。
七、结语和展望
质谱技术以其高灵敏度、高特异性优势在临床检验领域受到广泛关注，但其分析结果受样品特性影响较大，因此需要综合实验室设备、试剂成本、目标分析物的特性、检测通量要求等因素来选择合适的样品前处理方法，在保证检测结果准确可靠的前提下，兼顾样品前处理过程快速高效、批量化、自动化、环境友好、成本较低等考量因素。
随着质谱技术在临床应用的不断深入和前处理技术的不断发展，新型的前处理技术尤其是自动化技术将逐渐被开发并应用于临床。生物样品的分析有望实现从样品的采集、处理、分离到分析的完全自动化。本共识通过文献调研、用户调查、专家咨询收集的临床问题，重点对现有临床质谱前处理技术的主要原理、选择依据和临床应用进行了阐述，将适时修订，以满足临床规范化应用的需求。希望本共识推动解决临床检测样品前处理规范化发展的问题，在保证检测结果准确可靠的前提下实现临床检测更高效、更经济、更快捷的前处理过程。
工作组：
执笔人：周伟燕（北京医院 国家卫生健康委临床检验中心）
专家组成员（按姓氏拼音排序）：曹正（首都医科大学附属北京妇产医院检验科），陈发林（福建省临床检验中心），崔瑞芳（长治医学院附属和平医院），邓宇航（国家卫生健康委临床检验中心），杜璟（浙江省人民医院检验科），方慧玲（上海市临床检验中心），顾大勇（深圳第二人民医院），黄宪章（广东省中医院检验科），胡敏（中南大学湘雅二医院检验科），蒋黎（四川省人民医院检验科），居漪（上海市临床检验中心），李伯安（解放军总医院第五医学中心检验科），李宁（北京华大吉比爱生物技术有限公司），李水军（上海市徐汇区中心医院中心实验室），刘珍妮（国家卫生健康委临床检验中心），龙琪琛（中南大学湘雅二医院检验科），马晓丽（中国医学科学院 北京协和医院检验科），马紫嘉（国家卫生健康委临床检验中心），欧启水（福建医科大学附属第一医院），邱玲（中国医学科学院 北京协和医院检验科），孙志（郑州大学第一附属医院药学部），王恺隽（中国医学科学院 阜外医院实验诊断中心），夏骏（浙江省人民医院检验科），禹松林（中国医学科学院 北京协和医院检验科），张传宝（北京医院 国家卫生健康委临床检验中心），张钧（浙江大学医学院附属邵逸夫医院），张鹏伟（广东省中医院检验科），章申燕（北京华大吉比爱生物技术有限公司），赵蓓蓓（广州金域医学检验中心有限公司质谱中心），周伟燕（北京医院 国家卫生健康委临床检验中心），周洲（中国医学科学院 阜外医院实验诊断中心），邹迎曙（北京市医疗器械检验研究院 体外诊断检验室）
附录A：共识中的英文缩略语
B.1稀释法
典型实例：LC-MS/MS方法测定尿液样品中的肌酐含量 ［ 19 ］ 。
（1）96孔板中加入200 μl的同位素内标的乙腈工作液。
（2）加入40 μl的样品、校准样品或质控样品，密封后涡旋混匀3 min。
（3）3 000× g离心5 min。将上清液转移至96孔板中，然后注入LC-MS/MS进样分析。
B.2蛋白沉淀法
典型实例：LC-MS/MS方法测定人血清中伏立康唑、泊沙康唑、氟康唑和伊曲康唑 ［ 20 ］ 。
（1）取100 μl的样品、校准样品或质控样品，加入200 μl含 0.1%甲酸乙腈的沉淀剂（仅供参考）和100 μl的内标溶液（乙腈），涡旋混匀。
（2）17 000× g离心10 min，去除蛋白质。取上清液50 μl，然后补加100 μl 50%甲醇水溶液。涡旋混匀，上机。
B.3常规萃取法
典型实例：新生儿遗传代谢病筛查 ［ 21 ］ 。
（1）用打孔器将采集的高低水平质控血斑及待测样本血斑打出3 mm直径的血片，按顺序置于96孔板中，然后每孔加入100 μl内标工作液（溶剂信息未提供）。
（2）密封，在45 ℃条件下孵育震荡（130~150 g）45 min然后转移萃取液75 μl至上样板中，进样分析。
B.4液液萃取
典型实例：LC-MS/MS方法测定人血清样品中脂溶性维生素 ［ 22 ］ 。
（1）取200 μl的血清样品加入到塑料离心管中，然后加入30 μl的乙酸视黄醇（保护剂），最后加入800 μl的甲醇溶液（含有同位素内标），密封，涡旋混匀30 s。
（2）16 000× g离心10 min，然后收集上清液，加入800 μl的正己烷，涡旋混匀；此步骤可重复2次，从而提高目标分析物的提取回收率。
（3）收集正己烷层，并在45 ℃的真空条件下蒸发至干。
（4）将残留物溶于100 μl甲醇中，进样分析。
B.5固液支撑萃取
典型实例：LC-MS/MS法测定人血浆中醛固酮 ［ 23 ］ 。
（1）取450 μl的血浆样品、校准品或质控品，然后加入450 μl的50%甲醇配制的同位素内标溶液，剧烈涡旋混匀。
（2）将上述溶液800 μl转移至SLE板，然后静置5 min。
（3）分两次加入2.5 ml的MTBE萃取剂进行洗脱，然后将有机试剂在氮气下吹干。
（4）120 μl的35%的甲醇/水复溶，上机检测。
B.6固相萃取
典型实例：LC-MS/MS法测定人血清或血浆中的类固醇激素 ［ 24 ］ 。
（1）取100 μl血清或血浆样品，然后加入10 μl混合内标工作液（甲醇），最后加入100 μl甲醇溶液，涡旋混匀1 min。
（2）补加100 μl蒸馏水，涡旋混匀，然后离心，移取200 μl上清进行SPE的程序。
（3）SPE程序（仅供参考，实验室可自行设计方法）：
a. 活化和平衡：亲水亲脂平衡SPE柱（简称HLB）中先后加入200 μl甲醇和水。
b. 上样：将200 μl样品上清溶液加入已活化的SPE提取板中。
c. 淋洗：加入200 μl甲醇：水（1∶9，V/V）进行一次淋洗，然后再加入200 μl的正己烷溶液分别进行第二次淋洗。
d. 洗脱：加入40 μl乙腈：甲醇（9∶1，V/V）进行洗脱，收集洗脱液，然后向收集板中加入60 μl蒸馏水。
B.7磁珠法
典型实例：LC-MS/MS法测定人血浆中的儿茶酚胺及其代谢物 ［ 17 ］ 。
（1）准备含有磁珠（活化液）、平衡液、漂洗液和洗脱液的96孔预分装板。
（2）在96孔预分装的样品列加入400 μl的样本，然后再加入400 μl的同位素内标溶液。
（3）将加入样品的96孔预分装板加入到全自动样品处理系统（如EX-48），仪器自动进行磁珠的活化、平衡、吸附目标分析物、漂洗、洗脱等过程。
（4）完成提取程序，上机检测。
B.8超滤法
典型实例：LC-MS/MS法测定人血清中游离睾酮 ［ 25 ］ 。
（1）样品稀释：取500 μl的血清加入500 μl的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液稀释血清。
（2）超滤离心：将上述样品加入到超滤装置中，然后1 800× g，25 ℃，离心1 h。
（3）加入内标：将40 fmol睾酮的同位素内标加入到超滤液中，涡旋混匀，孵育5 min。
（4）游离睾酮的萃取：向超滤液中加入1 ml的甲基叔丁基醚（MTBE）萃取，40 ℃氮气下挥干。
（5）去除杂质：1 ml的90%的甲醇重组，加入1 ml的庚烷，将底部的甲醇加入到洁净管中，氮气吹干。
（6）重组上机：70 μl的50%的甲醇复溶，上机检测。
B.9平衡透析
典型实例：LC-MS/MS法测定游离甲状腺激素 ［ 26 ］ 。
（1）透析缓冲溶液配制：按照CLSI C45A指南的建议配制HEPES透析缓冲溶液。
（2）加样：96孔透析板中蓝色一侧加入200 μl的透析缓冲液，透明一侧加入200 μl的样本或质控样本。
（3）透析：将透析装置放入37 ℃恒温孵育箱中，旋转17~19 h，完成透析。
（4）平衡至室温：从孵育箱中取出透析板在室温平衡30 min。
（5）加入同位素内标：取150 μl的透析液加入到96孔板中，然后加入200 μl的同位素内标工作液，涡旋混匀。
（6）校准曲线配制：取150 μl的校准品加入200 μl的同位素内标工作液，涡旋混匀。
（7）上机检测：将样本和校准曲线转移至上样板中，进行LC-MS/MS分析。
B.10免疫亲和提取
典型实例：LC-MS/MS法测定人血清中1，25-双羟维生素D ［ 27 ］ 。
（1）免疫萃取：向每个含200 μl的固定抗体的反应杯中加入500 μl 的血清样品，加入25 μl的内标溶液，涡旋混匀孵育60 min。
漂洗：加入500 μl的水漂洗三次，5 000 × g离心1 min。
（2）洗脱：加入400 μl的乙醇洗脱。
（3）氮吹重组：洗脱液真空干燥，加入（7∶3，V/V）的甲醇水重组上机分析。
B.11衍生法
典型实例：LC-MS/MS法测定干血斑中的氨基酸和酰基肉碱 ［ 28 ］ 。
（1）取1~2个滤纸血点（直径3 mm的干血滤纸片，相当于3.2 μl全血），置于96孔过滤板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇100 μl，室温放置20 min，以提取血片中的氨基酸和酰基肉碱。然后离心转移上清至另一个96孔板中，氮气保护下50 ℃吹干，加入60 μl正丁醇（含3 mol/L HCl），密封，65 ℃孵育15 min进行衍生化。
（2）衍生后的溶液，在氮气保护下50 ℃吹干。用100 μl 流动相（一般为乙腈∶水∶甲酸=80∶20∶0.02）复溶，取20 μl进样，上机分析。
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