背景知识

        雄烯二酮是一种雄激素，属于甾体激素，含19个碳原子。主要是由脱氢表雄酮（DHEA）转化而来，随后转化生成睾酮和雌酮，因此雄烯二酮是中间产物，被称作激素前体。成年男性的雄烯二酮主要在睾丸合成，成年女性则主要在肾上腺和卵巢合成。造成雄烯二酮水平升高的疾病包括多毛症、多囊卵巢综合征、肾上腺增生以及库欣综合征。反之，肾上腺功能不全以及卵巢衰竭可能会造成雄烯二酮水平降低。

        临床检测甾体激素的常规方法主要是免疫法，但可能存在校准不当、容易受基质效应及其它干扰物质影响等问题，从而导致测量结果不准确，因此需要建立参考测量程序（Reference measurement procedure, RMP）以促进雄烯二酮检测的标准化。RMP可用于常规方法的评估、验证和校准，方法比较研究以及对争议样本（complaint samples）进行分析。

        2、内标溶液：购买100µg/ml 13C 标记雄烯二酮（androstene-3,17-dione-2,3,4-13C3，CAS 327048-86-2）乙腈溶液，实验室以50%甲醇水稀释。

        3、质控样本：选取雄烯二酮低，中，高浓度的临床样本。

        4、系统适配性样本：为保证方法的长期溯源性，每批次前先测定两个适配性样本，样本1由睾酮和雄烯二酮混合而成，用于检测色谱分辨率，样本2为低浓度雄烯二酮用于检测系统灵敏度。

        样本前处理：

        混合待测物和内标，使用硫酸锌水溶液（89g/l）/甲醇1/4 v/v作为沉淀剂，涡旋离心后取上清进行反相固相萃取，以水冲洗并用乙腈洗脱两次，收集洗脱液。

        仪器和色谱柱：

        LC-MS/MS：ABSciex QTrap 6500 coupled to an Agilent Infinity 1290 LC系统；色谱柱：Raptor biphenyl column (100× 2.1 mm, 2.7 µm)，Raptor C18 EXP保护柱(5× 2.1 mm, 2.7 µm)

        进样体积5µl，柱温30℃，流速500µl/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，分离梯度如下表。

        采用电喷雾电离多离子反应监测模式，在正负离子模式之间转换以避免带电。具体参数包括，气帘气，30psi；碰撞气，高；喷雾电压，5000V；温度，550℃；离子源气压1，60psi；离子源气压2，50psi；入口电压，10V。

        方法验证：

        1）选择性，无待测物的提取血清在雄烯二酮目标保留时间没有干扰信号；其它甾体类激素包括孕酮，睾酮，17-羟孕酮，皮质醇，11-脱氧皮质醇都没有显示干扰。

        2）特异性，采用柱后灌注法，将雄烯二酮纯溶液在色谱柱后质谱之前以恒定速度注入质谱仪，同时将处理后的血清样本注入色谱柱分析，结果表明分析物信号响应未受到干扰，无离子抑制或增强效应。

        3）基质效应，通过比较血清和血浆基质处理后加标以及纯溶液加标的测定结果，计算两者的比值，若比值＞100%表明可能存在离子增强效应，反之可能存在离子抑制效应。结果表明内标和外标都不存在基质效应。且纯溶液配制的校准液与血清基质的校准液的校准曲线斜率没有差异，r值均为1.00.。

        4）准确度和不精密度，采用血清和血浆加标的方式计算偏倚，血清样本和血浆样本的平均偏倚为-2%和-6%。5-12ng/ml范围内测量不精密度<2%，1.5ng/ml处的不精密度为3.5%，定量范围低限处的不精密度为5.2%。

        5） 线性和测量范围低限，建立三条校准曲线，各包含10个校准点，覆盖整个校准范围以及±20%的范围，结果三条校准曲线的相关系数r=0.999。测量范围低限定位0.05ng/ml。

        6）样本稳定性，加标的血清样本在-20℃下可稳定至少14天，处理后的血清样本可在避光和4℃条件下下稳定至少8天。

        7）  测量不确定度，计算得测量不确定度在6.6%-12.9%之间。

        溯源性：

        本研究中除了使用NMIA认证参考物质，还使用USP标准雄烯二酮自建qNMR方法，该方法可直接溯源到SI单位，可绝对定量，用该方法测定的NMIA标准物质结果与证书上的值具有一致性，因此该qNMR方法可以为标准物质定量，不必要一定使用有证参考物质，有利于参考方法长期溯源性。

        方法比较：

        用149个临床剩余血清将参考方法与一个常规LC-MS/MS方法进行对比，结果表明两者具有很好的可比性。将参考方法同时应用于另外一个实验室以验证参考方法的重现性，评估两个实验室同时应用参考方法测定112个患者标本的一致性，所得偏倚为0.9%，1.96 SD范围为-10.1-11.8%，满足＜18.1%的要求。

        结论：

        本研究成功建立了测定雄烯二酮的LC-MS/MS参考方法，方法具有高选择性和特异性，能可靠评估常规方法，促进常规方法的标准化和患者检测结果的溯源性。

        参考文献

        [1] Gradl, K., Taibon, J., Singh, N., Albrecht, E., Geistanger, A., Pongratz, S., ... & Kobold, U. (2020). An isotope dilution LC–MS/MS-based candidate reference method for the quantification of androstenedione in human serum and plasma. Clinical Mass Spectrometry,, 1-10.

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