10月8日，我们翻译并发布了大分子检测指南 | CLSI C64：蛋白质和肽类的质谱定量第一章，本期为第五章上，文章底部附有往期内容链接，欢迎感兴趣的同道查看。

• lS在蛋白质和肽工作流程中的重要作用的

• 选择合适的IS时考虑的关键因素

• 关于可以用不同类型的IS控制的加法顺序和错误来源的建议

• IS的来源、制造过程和质量要求的描述

内标（IS）用于控制前处理变异和基质效应造成的样本与校准品之间的测定变异。内标也可以作为质量保证（QA）计划的一部分，可为每个样本建立可接受的内标回收范围。蛋白质的内标相对于样本和校准品组成需要具有独特性，同时要与内源性分析物有相同的物理化学特性。使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质和肽的测定时，理想的IS应与待测蛋白质或肽具有相同的色谱特征和不同的质量（即，前体离子或母离子和产物离子质量）。蛋白质和肽理想的IS有许多特征与小分子LC-MS/MS测定类似（参见CLSI文件C62）。本章描述了小分子IS与蛋白质和肽IS之间的重点差异。

在一些小分子检测中，IS也被用作校准物。这种方法最初在2003年被引入至蛋白质上，但并不广泛适用于临床测定。主要出于两个原因，首先，IS肽可能无法充分代表生物学背景（它可能无法准确反映实际生物标志物在生物体内的自然状态和变化）。其次，由于特征性肽段经历了由蛋白质转化而来的过程，浓度和峰面积比可能没有相关性。根据C64的目的，IS仅用于控制和校正分析变异而不作为校准系统使用（见子章节6.3.2）。

子章节5.1.1和5.1.2描述了IS肽的两种类型，分子形式和应用。

5.1.1 合成

合成的IS肽通过固相化学合成，通过将单个氨基酸（天然的或修饰过的）按顺序连接起来。特别有用的能力是可以利用含有一个或多个稳定同位素的氨基酸来生成同位素标记的肽，其质量与天然对应物有明显区别。几乎任何氨基酸序列，最多可达60个氨基酸，都可以容易地合成，尽管产量和纯度随着长度的增加而降低。合成完成后，肽段从固相中释放出来，被浓缩并纯化以供使用。此外这种方法可以掺入非天然的、带有PTMs（蛋白质翻译后修饰）的标记氨基酸。

5.1.2 重组表达

表达的IS是工程化的细菌、酵母、哺乳动物细胞培养或无细胞蛋白生产系统中产生的蛋白质和肽。通常标准的分子生物学技术以及包含必要DNA序列的工程表达载体被用于蛋白质转录和翻译。在某些情况下，表达构建可能包括额外的氨基酸序列（例如，融合标签）以便于纯化和/或增强溶解性。在下游应用中应考虑这些标签的存在。当IS在含有同位素标记的15N-氯化铵和/或13C-葡萄糖（仅限于原核系统）或同位素标记的必需氨基酸（适用于原核、真核或无细胞系统）的培养基中时可以产生同位素标记的微克级纯化蛋白质。尽管是可能生成完全折叠和有生物学活性并具包含相关PTMs（蛋白质翻译后修饰）的蛋白质，但常规的生产并不常见。

5.2 常见的内标结构模体

IS的类型从肽到全长蛋白质，有不同的复杂度，也有多种策略可用于纳入稳定同位素标记（见图6）。化学和代谢标记程序使用容易获得的同位素标记氨基酸。一般13C和15N被整合到所有原子中，也有特定位置标记的氨基酸。可以进行一般或选择性标记，因此可以为特定的测定需求特别设计内标。
尽管有多种同位素标记的氨基酸可用，但有七种常用的氨基酸，其中所有碳和氮原子分别被13C和15N取代，它们相对便宜且广泛可用，可用于合成或代谢标记过程（见表4）。子章节5.5.2涵盖了关于最优同位素富集和所需质量差异的技术要求。

表4 常见的同位素标记氨基酸，完全的13C和15N替代

缩写：QconCAT，quantification concatamer（定量串联体）；SILAC，stable-isotope labeling with amino acids in culture（培养基中稳定同位素标记的氨基酸）。图6 几种常见的内标结构模体。星号的代表同位素标记的氨基酸，蓝色代表内标肽段，绿色代表侧翼氨基酸

5.2.1 同位素标记的蛋白质和蛋白质域

目前针对几种临床相关的蛋白质已合成了稳定同位素标记（SIL）的内标（IS）蛋白质。通过提供同位素标记的盐类或能量来源（例如15N-氯化铵、13C-葡萄糖），在生长过程中将稳定同位素整合到表达的蛋白质中，这将替换所有氮或碳原子。也可以在培养基中提供同位素标记的氨基酸以产生具有特定氨基酸标记（即在培养中带有稳定同位素标记氨基酸[SILAC]）的蛋白质（见图6）。所需的标记类型和程度取决于工作流程和分析物分子的质量。对于代谢标记，13C-饱和标记能为大多数（如果不是全部）肽段提供推荐的质量偏移（见子章节5.5.2）。15N-饱和标记适用于许多肽段。然而，小肽可能含有太少的氮原子以至于无法实现推荐的SILAC质量偏移（见子章节5.5.2）。

全长IS蛋白质的重组表达可能具有挑战性，特别是随着蛋白质大小的增加。一个常见的解决方案是表达全长蛋白质中的一部分或特定结构域，其中包含目标特征性肽段的同位素标记。如果感兴趣的结构域包含一个可用于亲和富集的功能性表位，这样的蛋白质也可以在前处理早期用于控制完整蛋白的回收。然而，这些结构域的设计和后续性能是经验性的，可能并不会比更易获得的合成肽段表现出更好的性能。

理论上，最佳的IS是一个全长标记蛋白质，它是功能性的，并且与天然分析物完全相同。这样的IS可以全程控制完整蛋白分析或蛋白酶解辅助工作流程中的变异。然而，生产这种物质的挑战很大，因此很少被合成。因此对作为IS的同位素标记物的性能进行严格评估是方法设计的一个必要部分。

5.2.2 可裂解肽段

可裂解肽段包括“翼状肽段”和串联可裂解肽段（即定量串联体）（见图6）。可裂解肽段的内标（IS）被设计为在目标肽段序列的N端、C端或两端包含侧翼氨基酸序列。通常，这些侧翼氨基酸序列被设计为与天然蛋白质中的序列相同。在体外蛋白酶解消化过程中，SIL标记的IS肽段与用于蛋白质分析的肽段一起被释放。由于缺乏天然蛋白质结构，可裂解肽段可能与蛋白质的消化动力学不同。然而，这种效应可能取决于不同的蛋白质。到目前为，可裂解肽段相对于全长蛋白质IS的实际优越性还有待证明。

串联可裂解肽段是可裂解肽段的一个特例，其中多个特征性IS肽段串联形成一个人造多肽，包含多个IS肽段，其间由连接的氨基酸间隔。方便的是，这些多肽可以释放出许多特征性肽段段，用于多重分析。此外还可以通过改变特征性肽段段的重复次数以满足肽段的不同丰度需求。与翼状肽段一样，串联肽段模仿天然折叠蛋白质的消化动力学的能力是一个重要的考虑因素。5.2.3 不可裂解肽段对于那些由肽段（而非蛋白质）定义待测物的分析（例如，表2中的肽段DRVYIHPFHL），同位素标记的合成肽段是理想的内标（IS），并且可以用于调整标准的小分子分析，如CLSI文件C62中所概述的那样。在蛋白酶辅助的工作流程中，不可裂解的IS与用于定量的特征性肽段具有相同的序列，但它们没有全长蛋白质的结构和生化特性，因此无法控制与蛋白酶解或预消化富集步骤相关的变异。然而，不可裂解的IS肽段能够控制蛋白酶解后的变异来源。

5.2.4 蛋白质和肽段类似物

非同位素标记肽段已被提出用作基于消化的工作流程中的内标（IS）。从概念上讲，一个具有与肽段分析物序列变异最小的合成肽段（例如，用苏氨酸替代丝氨酸）可以作为IS，其与特征性肽段具有不同的质量但化学性质广泛相似。对于蛋白质，三级结构和功能对于富集可能是必要的，当缺乏同位素标记的物质时可考虑使用另一物种的蛋白质作为IS。因为即使是保守的氨基酸替换也可能在丰富效率、色谱保留时间和基质效应方面与特征性肽段有显著不同，蛋白和肽类似物作为IS的适用性必须基于经验事实。