10月8日，我们翻译并发布了大分子检测指南 | CLSI C64：蛋白质和肽类的质谱定量第一章，本期为第六章上，文章底部附有往期内容链接，欢迎感兴趣的同道查看。

• 计量溯源的一致化和标准化介绍

• 从互换性的角度考虑外部校准系统

• 基质和校准物同病人样本等效性验证实验

在临床上使用的蛋白质和肽段测量程序均需要进行校准，这个过程将被测量和计量学相联系。通常，校准被表示为已知的分析物的量与观测到的响应因子之间的关系，根据此关系和样本的响应可计算样本浓度。“校准物（calibrator）”是校准物（calibrant）和校准基质（calibrator matrix）的总和。校准系统的计量溯源性降低了校准偏倚的可能性。CLSI文件C62A详细描述了质谱测量校准的原则，本指南针对蛋白质和肽段质谱定量的校准原则进行了总结。

方法开发通常从一个实验室的一个分析平台开始。然而，方法的广泛应用意味着多个实验室和多个平台。当检测结果依赖于平台和/或实验室时，诊断质量可能会受影响，临床检测的一致化和/或标准化可以帮助减轻这种问题的影响。

校准对于一致化和标准化至关重要，应在方法设计时仔细考虑。本指南并不强制要求建立适于一致化或标准化的校准策略，但若多个实验室要将方法转化以便于更广泛的临床应用，设计稳健的校准策略将能提高诊断质量。

6.1 一致化

 一致化是使实验室结果等效化的过程，即使它们不能溯源到更高级的一级参考物质或方法。一致化不如标准化要求那么严格，它的最终目的是达到测量程序之间的一致性，其原理是基于实验室能够针对一个公认的参考标准建立测量方法。一致化需要国家和国际层面上的广泛合作，这是具有挑战性的，然而，其优势包括：能进行稳健的临床结果研究、在不同时间比较结果、能标准化参考区间或决策点，以及使医生之间的结果可比。例如，在标准化的糖化血红蛋白测量中（见第3.4子章节），使用一致化的LC-MS/MS方法或HPLC亲和方法可以得出一致的测量结果，并在定义的医学决策点时提供预期的临床用途。

6.2 标准化

标准化是通过使用更高等级的一级参考物质或测量程序使实验室结果等效化的过程。测量标准化依赖于被测量和参考测量程序（RMP）的溯源性（以国际单位制（SI）单位定义）。这些基本组分用于产生一级参考物质。一个具有互通性的参考物质是足够均匀和稳定的，并且具有规定的特性以适应其预期用途，此外，通过两种测量程序对参考物质的测量结果一致性信息也会被说明。参考物质通常由认证机构提供并在二级参考测量程序中使用以向二级校准物赋值。然后，这些二级校准物随后被其他实验室或厂家广泛使用以提供具有溯源性、准确的结果。从一级参考物质到校准物的每一步的测量不确定度会被确定以确保检测方法的误差不会超出误差预算。这些概念在临床化学文献中已被详细描述。

鉴于定义蛋白质被测量存在挑战，其标准化在概念上和实际上都比较困难。国际参考物质制备物可减少这种困难。然而，有证据表明这些制备存在变异性。例如，催乳素的制备物的糖基化存在变异（例如，国家生物标准与控制研究所的试剂98/582、97/714和98/580）。此外，促甲状腺激素和IGF-1制备物的差异也被描述过。除了这些限制之外，大多数临床相关的蛋白质还没有参考测量程序。幸运的是，质谱（MS）在原理上是一种高级别的方法学，是一些参考测量程序的基础。因此，MS在转化科学方面有着巨大的优势。作为一种中心技术，MS可以用来发现生物标志物，定义被测量，产生具有溯源性的参考测量程序，向参考物质赋值，并最终以明确定义的效用支持临床使用。

6.3 校准方法

响应因子是检测器响应与样本中存在的分析物分子数量（即分析物浓度）之间的关系。相应地，在基于质谱的蛋白质测量程序中，响应因子不仅由质谱仪内的回收率（例如，离子化、碎片化、传输、检测）决定，还由整个分析过程中分析物的回收率决定（例如，蛋白质富集、蛋白水解、肽段富集）。理想情况下，所有待测样本的响应因子，包括校准品和质控样本应是相同的。然而，随机变异、误差的互通性和/或基质效应都能导致响应因子变异。
在基于质谱的蛋白质测量程序中，每个分析物的响应因子通常是一个被标准化的响应。通常，响应因子是分析物响应（大多数情况下是色谱峰面积）与内标响应之比，这个基本关系被用于质谱定量的校准。

6.3.1 外部校准

医学实验室中蛋白质质谱和肽段测量的校准策略通常使用同位素稀释外部校准。这种方法要求在样本处理过程中向每个待测样本、校准品和质控样本中添加等量的IS。在数据处理时，将分析物与IS响应比（通常是色谱峰面积）绘制在y轴上，校准品中分析物的浓度绘制在x轴上即可绘制校准曲线。通常使用最小二乘法以及适当的加权回归拟合校准曲线以生成线性或二次方校准方程。可以使用二次方校准等式，但在常规实施之前需要对非线性的校准进行充分研究，临床样本的浓度随后可以使用IS标准化的相应因子通过校准曲线确定。

6.3.2 内部校准

内部校准的同位素稀释需要向待测样本和质控样本中加入已知量的IS。对于未知样本，分析物与IS响应比值乘IS量即可确定待测浓度。
分析物浓度=分析物响应/内标响应*内标浓度 （2）
这种校准方法不推荐用于临床。首先单点校准可能限制方法的动态范围，因为响应因子不可能在分析测量范围内（AMI）相等，尤其是临床上浓度范围大的分析物。其次，分析物与内标响应比值可能与摩尔比值并不相同。同位素分布的变化可能造成偏倚，这取决于IS同位素标记的效率和程度。最后，蛋白水解辅助的工作流程尤其易受内部校准误差的影响。正如本指南描述的，IS蛋白的富集、消化动力学和蛋白质形式的复杂性很难等同于天然蛋白。因此分析物与IS响应比值很难校正这些误差。

6.4.1 互通性缺乏相关的误差

互通性是一个参考物质或校准物的特性，它使得两个具有相同被测量的测量程序的样本结果能具有一致性。对于分析物未被明确定义的蛋白质方法的校准品，实现互通性比较困难，尤其是当比较方法使用分子识别方法时，因为其与MS方法有不同的基质效应（例如，表位识别的异嗜性干扰vs离子抑制）。

导致不互通的情况，举个例子，单一蛋白形式的校准物与内源性蛋白形式在一种条件下消化效率相同，但在另一组条件下则不同。因此，两个方法可能会表现出系统偏差。即使是完整蛋白形式的工作流程，校准物可能会经历与内源性蛋白不同的基质相互作用。在开发前处理工作流程时，方法开发者需要详细阐明并纠正任何观察到的差异（见第7章）。
IFCC工作组最近提出了确定互通性的标准，这有助于为蛋白质和肽段质谱定量选择合适的校准物。对于没有比较方法或参考物质的新方法则无法评估互通性。然而，仔细的设计和赋值（见子章节6.8.2）可以简化未来的评估。

6.4.2 基质效应来源的误差

对于蛋白质质谱测量，基质效应通常表现为在外部校准物（通常在替代基质中）的分析物的响应因子与天然基质样本（即测试样本）之间的差异。通常情况下，基质效应主要由分析真实样本基质和校准物之间的盐、脂质、代谢物和蛋白质的差异影响造成的，这些在样品制备和色谱分析中并未完全校正。然而，工作流程中的每一步都可能受到基质效应的影响。例如，某些样本中可能存在与亲和树脂结合的蛋白的竞争性抑制剂，但在校准品中完全不存在，这导致基质特异的富集效应。相似地，校准物替代基质的组分可能降低校准品中蛋白的消化效率，降低回收率。值得注意的是，蛋白酶辅助工作流程可能导致每个肽段受到的基质效应不同。
方法开发者能通过样本前处理改进、色谱和IS的合理使用来最小化基质效应（见第5章）。方法开发和预验证性能应被仔细评估以最小化和控制校准品和天然样本之间由可能的基质效应造成的定量差异。CLSI文件EP14提供了评估策略。

6.4.3 赋值来源的误差

检测方法中校准品浓度赋值的重现性对于确保不同批次校准品的计量溯源性至关重要。子章节6.8讨论了校准品赋值的各种方法。然而，这些过程的变异会导致测量程序的误差。此外，赋值方法的选择也会影响校准品的互通性。

理想的校准品基质应与待测样本的基质一致。临床测量的通常为靶向内源性蛋白质而非治疗用途的蛋白质，这使获得无分析物的天然基质很难。替代基质是合适的选择，但这需要评估基质效应和潜在干扰，目的是表明校准品和未知样本间应答因子的一致性。CLSI文件EP06提供了基质等级以供参考。子章节6.5.1到6.5.4以优至劣的顺序列出了常见蛋白质和肽段质谱检测方法中使用的校准品基质。

6.5.1 无分析物的真实基质
对于测量内源性蛋白质和肽的方法，无分析物基质是校准品基质的最佳选择，同时与待测样本（比如肝素锂血浆、EDTA血浆，红头管血清）包含浓度相同的添加物。对于靶向内源性蛋白质的方法，可能确实有分析物缺乏的临床样本。比如，经历了甲状腺切除术和消融治疗的病人可提供无甲状腺球蛋白的血清，这些病人的样本可以被混合成样本池，可在降低个体特定的效应同时保证长期基质制备的重现性。

6.5.2 去除分析物的真实或替代基质
可从基质中剔除分析物以形成替代基质。蛋白质可通过免疫方法选择性去处。或者可以使用化学方法（比如，活性炭去除，聚乙二醇沉淀）大体上去除一些蛋白质。这两种情况中，现有的可有效去除的分析技术都很有限。活性炭通常非特异性消除多种组分，会较大程度改变基质组分并会有一定的试剂残留问题。虽然价格便宜容易获取，但是去除分析物的基质的适用性和等效性应被仔细评估。

6.5.3 替代的物种基质
用其它物种（比如马，牛，山羊和鸡）的相同体液的天然基质做为替代基质通常较方便。一些情况下，动物基质中或许完全不含目标分析物。更为多见的情况是动物的蛋白质同源物具有完全不同的氨基酸序列，因此许多（如果不是全部）潜在的特征性肽段不会在不同物种之间共有。但应该查询蛋白质的序列数据库以确保替代基质中不包含任何可直接干扰定量的肽段。动物基质的组分也应该考虑，因为脂质或蛋白质浓度或蛋白质种类组分可能影响样本处理和特征性肽段的产生。

6.5.4 合成的替代基质
对于血清或血浆的分析，无分析物的替代基质可使用小牛血清白蛋白或人血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液。大量的白蛋白通常不纯。重组的无其他蛋白污染的人白蛋白可商业化购买，但与天然HSA在功能上不同。人工基质与天然基质组分通常有明显差异，需要仔细评估。