10月8日，我们翻译并发布了大分子检测指南 | CLSI C64：蛋白质和肽类的质谱定量第一章，本期为第六章下，文章底部附有往期内容链接，欢迎感兴趣的同道查看。

第六章： 校准

本章包括

• 计量溯源的一致化和标准化介绍

• 从互换性的角度考虑外部校准系统

• 基质和校准物同病人样本等效性验证实验

6.6 校准物的选择

选择正确的校准物对确保测量程序的准确性和正确度至关重要。理想上，校准物与被测量有相同的分子形式，包括一级、二级、三级和四级结构以及翻译后修饰，但很难获得。幸运的是，校准物和分析物不一定必须完全等效，方法开发以及IS，校准物和基质的仔细评估能最小化并控制不等效导致的偏倚。

6.6.1 包含天然蛋白质的样本池

包含分析物的天然样本池是理想的校准物，其应该由具有相似人口统计学特征的供者样本混合而成以最小化校准物的批间变异并代表平均生理组分。
使用供者样本池作为校准物有一些局限性。首先校准范围受限于供者样本的浓度，因为浓度最高的供者样本会在混合过程被稀释，所以混合池的浓度会低于一些患者样本的浓度。此外，基质的复杂性使得不能用标准计量学方法（比如，分光光度法，重量发，氨基酸水解法）对这类校准物赋值。理想情况下，校准物应用更高计量学的测量程序或者与一级参考物质平行分析（见子章节6.8.3）来赋值。

6.6.2 纯化天然蛋白制备的校准物

由于收集供者样本通常很难，因此可以选择用纯化的蛋白或肽段等和合适的基质来制备校准物体。这个方法能产生较宽的校准范围。在性能可接受的情况下校准物浓度可自行决定。校准物纯度和表征的要求大体与IS的一致，见子章节6.7.1。

理想情况下天然蛋白质从人源纯化并在表征和赋值后认证为参考物质。可作为参考物质的蛋白质数量很少，因此实验室经常使用商业来源的纯化蛋白并在自己实验室内进行表征和赋值。目前IFCC和WHO的标准和参考物质有一个列表可供选择。

或者是赋值的校准物可由天然蛋白制备，储存物质需要>90%的纯度以及足够的浓度以在稀释时体积改变小于5%。满足这些要求的物质可通过标准计量学方法赋值并用合适的基质稀释。为确保互通性，赋值需要另外一个检测方法确认。

类似地，纯化的重组蛋白可作为校准物，但需要注意其与天然蛋白理化性质的差异。重组表达系统可能会产生非天然的肽或氨基酸。包含亲和标签的蛋白的表达尤其需要注意，他们有时候是整个蛋白。同样地，无法保证合适的折叠和翻译后修饰。对于蛋白酶解辅助的工作流程，重组蛋白异常可能会改变代理蛋白和肽分析物相对于天然蛋白分析物的化学计量学特性。

6.6.3 替代校准物

通常，非全长蛋白质的替代校准物被用于蛋白水解辅助工作流程的设计。替代校准物通常是合成的可裂解或不可裂解的特征性肽段。重组技术也可被用于产生肽串联体或蛋白结构域。但这些替代校准物的消化行为可能都不同于天然蛋白质分析物，这可导致校准物响应因子的误差。由于特征性肽段校准物和内源性分析物理化性质的差异更大，他们的消化行为通常有明显差异，因此，方法开发者应该在排除其它更好的选择（天然样本池或重组蛋白）之后再考虑使用替代校准物。

6.7 校准物的认证

校准物认证的目的是表明校准物与内源性分析物的响应因子一致。方法开发者应在开发和预验证阶段评估基质和校准物效应，以保证响应因子的一致性。许多这样的实验应该在正式验证期间进行（见第8章）。子章节6.7.1至6.7.3中描述的实验应使用来自预期试验群体的多个真实基质标本进行。

6.7.1纯化蛋白质校准物的认证

理想情况下，作为校准物的纯化蛋白质应为根据国际标准进行赋值的认证参考物质（CRMs）。方法开发者应仅在能够确保遵守重构指南的情况下使用蛋白质CRM。对所述程序的任何更改都必须经过验证。

校准物的认证与IS的认证类似（见子章节5.5），但在评估身份和纯度方面要求更严格。认证的目的是最小化批间变异并确保赋值的长期正确度。开发者应通过适当的色谱技术对每批校准物进行纯度确认，以识别任何影响赋值准确性的蛋白污染物。开发者应执行质谱完整质量表征和序列验证来确认每批新校准物中的蛋白质身份。杂质应通过标准的蛋白质组学技术和氨基酸分析（AAA）识别。对于商业校准物，如果生产控制良好，批次间完整质量和纯度一致则可不需要进行蛋白质组学表征。在使用新校准物之前，开发者必须解决或校正任何理论和实验确定的质量的差异以及氨基酸组分的改变。

6.7.2 加标回收，标准加入和混合实验

一个控制良好的测量系统应对添加到真实基质中的外源性分析物准确测量。通过相关实验可以表明测量的准确性，如本子章节所述。
在加标回收实验中，已知量的校准物被添加到真实基质的检测样本中并使用方法的外部校准曲线进行定量。未加标的测试样本同时被测量以确定内源性分析物的基础浓度，这样可以根据公式计算加标样本的回收率：

%回收率=100[(a-b)/c]  (3)

其中：a = 加标样本的测量浓度b = 未加标样本的测量浓度c = 添加的分析物的已知浓度

实际上可对加标样本体积进行校正以弥补加标过程引起的体积变化。加标体积应最小程度稀释真实基质样本以免改变其组成（理想情况下体积变化< 5%）。最低加标水平的浓度应明显不同于未加标样本的基础浓度。回收率的偏差表明产生了基质效应，导致校准物在校准品基质中与真实基质中的响应因子不同。它并不一定表明无分析物基质中的校准物的响应因子与真实样本基质中内源性蛋白质分析物的响应因子不同，但它表明校准物与真实基质样本不具有互通性。

标准加入法是加标回收实验的扩展。它假设无基质效应，用于估计内源性蛋白质或肽段的量。在最小稀释前提下，该法将校准物添加至提前定值的病人样本中以构建一系列具有不同浓度的样本，得到的曲线通过最小二乘法线性回归拟合，使用x轴截距来确定分析物浓度。

在混合实验中，高浓度和低浓度样本的制备和分析应返回与制备体积比一致的测量结果。这个实验可以通过混合两个真实基质样本或将高浓度校准物与低浓度真实基质样本混合来进行。CLSI文件EP07描述了高浓度和低浓度样本的混合制备和分析并涵盖了体积组合（例如，3:1，1:1和1:3 [v/v]）。混合样本被作为未知样本进行测量，并确定相对于预期值的偏差，同时需要考虑到样本由于混合而发生的体积变化。

6.7.3 基质等效性研究

一个系统中如果校准物和真实基质的响应因子相同，那么在替代基质和真实基质中对校准物进行系列稀释时应该产生平行的稀释曲线。当与加标回收和混合实验相结合时，成功的基质等效性研究或许是支持校准物互通性的最佳证据。方法开发者应按照CLSI文件EP06所述，使用已建立的校准系列作为外部校准来确定用代理基质稀释的真实基质样本的浓度。稀释后的真实基质的计算值应与整个范围内的体积稀释成比例，从测量范围上限（ULMI）的50%至90%到接近LLMI的水平。建议使用多个单独患者样本，因为混合样本减少了识别患者特异性基质效应的能力。

用于评估质谱测量的基质等效性研究与用于评估免疫测定的实验策略形成对比，在免疫测定中，基质干扰通常通过稀释（即平行主义）解决。免疫测定平行实验旨在确定内源性蛋白或肽段分析物的响应因子与稀释在替代基质中的校准物的响应因子匹配所需的最小稀释度。平行实验评估通常不适用于质谱测定，因为质谱测定中的基质效应通过分离、富集和色谱法解决。然而，基质等效性研究与免疫测定平行实验密切相关。对于质谱法测定蛋白质或肽段，用无分析物的替代基质稀释高浓度患者样本可以揭示内源性蛋白质或肽段的基质效应。

6.7.4 批次比较

考虑到蛋白质校准物的复杂性（例如，分子形式的异质性、潜在不稳定性、基质效应、非特异性吸附），方法开发者应在开发早期评估多个校准物批次的批间差异。应从相同批次的原材料（即校准物和替代基质）制备多个工作校准物批次，但应独立赋值以确定生产和赋值程序的可重复性。同样，还应从不同批次的原材料（即校准物、替代基质或两者）制备多个校准物批次以评估原材料变异性。

6.8 浓度赋值方法

尽管一致化和标准化程序设定了校准物质生产的最高标准，但很少有临床分析物达到这种程度。出于实用目的，许多实验室成功地使用了低级程序。然而，应认识到这些程序的潜在不足，特别是当需要在实验室和/或方法之间进行值的传递时。

6.8.1 通过高等级方法直接对校准物赋值

理想情况下，校准物应通过使用包含互通性参考物质（RMs）和参考测量程序（RMP）的溯源链进行赋值（参见CLSI文件C37）。在没有RMP的情况下，校准物赋值必须溯源到CRM或预测方法。高等级的方法比如分光光度法、氨基酸分析（AAA）和氮分析等满足这些标准，并且适用于制备校准物的纯化蛋白质和肽段（但不适用于真实基质中的分析物）。这些方法应可追溯到CRM，使用适当的质控物质并被验证。

6.8.2 通过值传递向校准物赋值

通过使用合适的预测方法，一组在分析测量范围（AMI）内分布的天然样本被赋值。这些已被赋值的天然样本被用作新方法中的校准物向新方法的校准物赋值。或者，天然样本可被作为未知样本通过新方法处理，然后调整校准物的浓度以校正天然样本的回收率。两个测量程序均会影响不确定度（见CLSI文档EP 32）。
理想情况下，应用于样本值传递的预测方法是更高级别的方法，最好是RMP。在没有RMP的情况下，预测方法应可追溯到CRM或标准RM。当预测方法有明确定义的目标以建立临床效用时，后者方法是一致化的基础。

6.8.3 通过参考物质向校准物赋值

有时，RMs具有互通性但未被更高级的测量程序赋值。在这种情况下，直接使用这些RMs作为工作校准物可以标准化新方法（如果RMs的量不受限制）。或者，这些RMs可用于向校准物赋值。在后一种情况下，工作校准物浓度应调整，以确保RM回收率，其不确定性受新测量程序的影响。通常，使用RMs提高了互通性，尽管改进的程度取决于RM的质量。RMs通常是单一浓度，因此只提供单点校准参考。在这些情况下，非线性可能导致多点校准物赋值的偏差。应开展适当的实验以证明线性。

6.9 翻译后修饰的校准

6.9.1 翻译后修饰的绝对定量

所有PTM校准物质应通过对纯度评估的形式进行验证（见子章节5.5），包括目标PTM的预期质量。因为翻译后修饰的校准物可能含有少量残留、未被修饰的形式，所以方法开发者应通过同位素稀释LC-MS或其它方法确定修饰与未修饰形式的质量比。

开发者需要对可能被测量的每种PTM进行校准。然而，测量多种PTMs可能难以获得一套完整且适当的全长校准蛋白。在这种情况下，使用被修饰的肽作为校准物来校准蛋白酶解辅助法是唯一可行的选择。这种方法只有在未修饰的全长蛋白质形式也可用作校准物时才可能成功。然而，这种方法假设给定的修饰不影响特征性肽段的释放和回收，这可能并非真实情况。

6.9.2 翻译后修饰的比例定量

当预期被测量是具有特定PTM的目标蛋白质的分数时（例如，HbA1c或糖化白蛋白），有两种校准选择。方法开发者可独立地校准和定量每种蛋白质形态（修饰和未修饰），在这种情况下，后续在数学计算中确实使用了两个被测量。获得每种蛋白质形态的已定义量的校准物可能比较困难。因此，校准两种形态的比值而非各自的绝对量更简单。在后一种方法中，只有一个被测量。修饰和未修饰蛋白质形态比例已知的校准物被测量。然后，将两种蛋白质形态（修饰与未修饰）的测量响应比值绘制在y轴上，已知量绘制在x轴上来获得响应因子。理想情况下，校准物应通过适当的RMP进行赋值（见子章节6.8.1）。

6.10 常规生产的实际应用