自2024年10月8日起，我们陆续翻译并发布了大分子检测指南 | CLSI C64：蛋白质和肽类的质谱定量文章，本期为第七章：方法开发-经验性优化。文章底部附有往期完整内容链接，欢迎感兴趣的同道查阅。
第七章：方法开发
本章包括
• 从计划到经验优化的方法开发策略
• 方法开发中的实验设计指南（含有推荐的结果）
• 推荐的预验证实验，用于跟踪进展并降低正式的方法验证相关的风险
7.3 经验性优化
在项目计划阶段建立的被测量定义在很大程度上决定了初步的检测工作流程，为方法开发提供了方向。对于完整蛋白分析，被测量和基本检测工作流程通常已被定义，可以优化方法参数以达到预定分析要求。对于基于分解的方法，被测量的最佳特征性肽段也可能通过先前的方法或特定修饰位点所在位置被定义。当开发基于分解的方法或为未被定义过的测量物建立方法时，方法开发的重点集中在通过实验从一系列计算机模拟分解的肽段中识别出足够定义被测量的特征性肽段（见7.2小节）。图10描述了最有效的优化过程。
随着开发进程的推进，开发者应进行方法选择性、准确性、稳定性、可重复性（从样本准备到色谱和质谱分析）的粗略测试，以评估被测量或可能在检测中使用的特征性肽段。表7列出了精炼被测量定义的实验考虑因素。
表7 可优化改进方面的总结
图10 可优化改进方面的总结（经Hendrik Neubert许可）
7.3.1 标准化
在项目开发的早期，确定检测方法是否会参加标准化或一致化程序很重要。方法开发者应确定校准和质量控制的方法，并确定校准品、参考物质和商业质量控制材料的可用性，这些是检测开发、验证和随后常规所需的。从方法开发时就参与或建立一个合适的能力验证项目可能会很有用。
在蛋白质和肽的分析方法验证期间，将该方法与其他可用的测量程序进行比较可以评估准确度和正确度。因此，在开发的早期阶段最好确定是否有同一被测量的比较方法（参考程序或其他验证方法）。对于没有比较方法的新方法，开发者需要使用临床患者样本评估新方法的临床性能，并建立方法的溯源性（见第6章）。
7.3.2 液相色谱-串联质谱
CLSI文件C62中描述的原则也适用于蛋白质和肽LC-MS/MS检测方法的开发。将纯化、认证的分析物标准物质制备成溶液并通过质谱分析以表征前体离子质量和电荷状态，以及MS/MS的特征产物。方法开发者首先优化各种离子化、碎片化和离子光学参数，然后在确定色谱条件后重新优化或验证它们。对于分解后产生的特征性肽段的检测，在早期开发中使用粗肽或分解的蛋白质标准物比较方便。然而，这些物质本质上是不纯的，可能会出现干扰。例如，一个较大的蛋白质标准物分解后可能会产生数百个独特的特征性肽段，这些肽可能会相互干扰。因此，用于定义分析物（即完整蛋白质或特征性肽段）检测的MS和MS/MS特征属性应使用分析物的纯化、认证标准（即纯化的完整蛋白质或纯化的合成肽）建立。开发者可以使用纯化的、同位素标记的肽代替未标记的合成肽，因为它们预期将以相同的方式离子化和碎片化。对于完整蛋白质的分析，应使用天然蛋白质分析物进行MS方法开发。
7.3.2.1 离子化效应
除了LC流动相组成外，几种物质（例如盐、脂质、其他肽）也会影响分析物的离子化效率。尽管使用同位素标记的内标（IS）可以校正离子化抑制（和增强）的影响，但最好避免这些干扰源，因为它们可能影响检测的灵敏度。
方法开发者可以通过柱后灌注提取后的患者样本、提取的校准基质和无基质对照（例如，流动相）评估离子化效应。将无基质对照灌注与提取后样本的灌注谱图进行比较，可以帮助识别离子化效应的区域。
或者，作为MS或LC-MS分析之前的最终样本制备步骤，开发者可以通过向提取的样本和提取的校准物中加入IS，以及向无基质对照（例如，溶剂）中加入等量IS来评估离子化效应。无基质对照中的IS响应表明在没有基质效应的情况下的最佳离子化。将无基质对照中的IS响应与提取样本中加入的IS响应进行比较，可以帮助识别基质效应。对于外源性分析物，开发者可以添加未标记的分析物，或者在比内源性分析物浓度高至少20倍的浓度下加入（即，使内源性分析物信号可忽略不计）。值得注意的是，这种方法适用于基质辅助激光解吸/电离检测或LC-MS检测。然而，无基质对照中加入的IS可能会存在吸附丢失从而影响结果。
改变分离或样本制备条件可能会减少离子化效应。然而，对小分子有效的化学提取方法通常不会改善分解肽的结果，因为干扰通常是类似化学性质的高丰度肽引起的。如果工作流程允许，解决基质效应的最佳方法是先将蛋白质分析物与引起离子化效应的更丰富的蛋白质或干扰肽的底物（源自蛋白质的消化过程）进行分离。7.3.5小节讨论了分离干扰蛋白质的技术。在某些情况下，调整色谱条件将干扰与分析物分离开可能会解决问题。
7.3.2.2 质谱检测选择性
方法开发者可以通过空白基质对照研究和离子比值监测来评估MS分析的选择性，监测多个离子，并比较它们的强度（见8.9小节）。在MS/MS中，固定实验条件下（即仪器参数）的产物离子的相对强度是分子离子的基本属性。它也是传统毒理学筛选中使用的光谱指纹识别的基础。在MS/MS中，大多数蛋白质和肽会产生一系列特征产物，这些产物可能对定量分析以及离子比值监测有用，只要碎裂模式与分析物的大小匹配（见4.1小节）。MS/MS未产生独特的二级产物离子的情况下，可以通过比较同位素峰的相对丰度来监测同位素比值，其相对丰度主要取决于碳原子或具有丰富天然同位素的原子的数量（如硫、氯）。
在LC-MS/MS分析中，对于标准品和提取的和/或分解的患者样本，监测多个产物离子或SRM通道（选择性反应监测）。可使用给定分析中每个产物离子或SRM通道的峰面积计算离子通道比值，通常计算为定性离子对峰面积除以定量离子对峰面积的比值。理想情况下，无基质分析中观察到的离子通道比值可以用来定义为没有干扰的预期离子通道比值。因此，如果在提取样本中测量的离子通道比值与标准品测量的显著不同，则可能存在同质异位素干扰。
基质效应可以通过改变同一分子离子前体的碎片化路径来改变电荷的定位。因此，在提取样本中测量的离子通道比值可能与在没有基质和有同质异位素干扰的情况下观察到的不相同。在这些情况下，可以使用校准物中测量的离子通道比值来建立预期的离子通道比值。此外，可以使用未标记的特征性肽段的离子通道比值与标记的IS内标肽的离子通道比值进行比较。随着时间的推移，由于仪器性能漂移，预期的离子通道比值可能会发生变化，在建立标准时，应考虑这种可能性。
在早期方法开发中，监测每个分析物的多个SRM离子通道，并检查离子通道比值的稳定性，以确定最具有选择性的离子通道。随后，开发者应在验证期间测试离子通道，以确认离子通道在患者样本中的选择性。以上这一步骤对于每个分析物以和IS都要执行。
在没有可行的定性离子通道的情况下，可以使用具有不同碰撞能量的定量离子通道作为定性离子通道。或者，可以将监测的定量离子通道的前体离子m/z增加1个m/z，以便将同一前体的不同同位素作为定性离子通道进行监测。然而，使用相同的前体和产物离子对，选择不同的碰撞能量或同位素，既作为定量离子通道又作为定性离子通道，会使得离子通道比值的监测对同质异位素干扰的敏感性降低。
7.3.2.3 液相色谱开发
在CLSI文件C62中概述的用于小分子色谱分离的原则也适用于蛋白质和肽。大多数高分辨率的蛋白质和肽分离是通过使用离子对试剂的反相分离完成的。然而，本指南既不对用于临床检测目标蛋白质或肽的色谱模式做出假设也不强加要求，只要分离是稳健的，并且能够提供满足预期临床需求的色谱选择性。LC方法的性能同时取决于色谱分离条件的优化和上游样本的制备步骤以及下游MS检测提供的选择性。因此，LC参数经常在检测开发过程中与其他方法参数一起多次优化。通常，方法开发的最后一步是减少LC运行时间，以便在不牺牲选择性、灵敏度和重现性的情况下实现更高通量的分析。
方法开发期间可使用多种类型的样本来优化LC液相色谱方法，包括低纯度标准品、分解的蛋白质标准品，以及分解和/或提取的天然样本。实际上，优化LC方法参数必然需要使用处理过的天然样本，以确保所有同质异位素干扰和离子抑制剂都能在色谱上得到充分分离。然而，方法开发者应使用纯化的标准品确认完整蛋白质或特征性肽段的色谱保留特性。当使用13C或15N标记的类似物作为内标（IS）时，它们可以发挥相同的作用，因为它们的保留特性预期与纯化标准品相同。
7.3.3 过程回收率
无论使用哪种方法，感兴趣的分析物蛋白或特征性肽段在分解或富集过程中的回收通常是不完全的。然而，回收率在所有生物样本和分析测量区间（AMI）中的重现性尤其重要，这样才能确保方法在预期人群样本检测中具有可重现的分析性能。因此，方法开发者应在方法开发和性能评估期间对回收率进行评估。
为了评估样品处理过程的回收率（不要与准确度混淆），开发者需要比较在富集前和富集后向样本中添加分析物时分析物的响应。在富集回收外源性分析物（例如，生物治疗药物）时，添加顺序实验最容易理解和实施，因其可以添加到无分析物的真实样本基质中。富集前和富集后添加分析物的测量响应表明了分析物经过富集步骤时的回收率。因为无论何时添加分析物测量的都是在提取基质存在的情况的分析物的响应，因此这个实验不受离子化效应的影响。实际上，如果等量的分析物被添加到无基质的溶剂中，开发者可以通过比较提取基质中的分析物响应（富集后添加）与无基质溶剂中的分析物响应来评估电离抑制或增强，尽管分析物响应可能会在没有基质的情况下受到吸附损失的影响（见5.3小节）。
值得注意的是，许多蛋白质测定的添加顺序实验往往容易受到样本中的分析物通常是内源性物质的困扰。在这种情况下，开发者可以添加更大数量的外源分析物，使得内源性部分相比之下可以忽略不计。或者，可以添加分析物的稳定同位素标记物（SIL），因为类似物不是样本内源性物质。此外，许多蛋白质测定的添加顺序实验还因分析物改变了分子形式（即，从蛋白质到肽段）这一事实而变得更加复杂，所以必须同时添加完整蛋白和特征性肽段以便全面表征基于酶解的工作流程中每个步骤的回收率。
添加顺序实验在方法优化期间可用于比较富集和分解的不同参数（例如，孵育时间、添加剂、pH、缓冲液）。它们在评估校准品基质和样本基质在工作流程特定步骤中的回收率时也是有用的，可以识别和减轻潜在的基质效应或干扰。在预验证性能评估期间，开发者应在代表性的患者样本集、校准基质和质控品中证明可重复的过程回收率。然而，分析添加顺序实验数据的人员应明白一点，由于一些原因，加入的外源分析物的回收率并不一定能反映内源性分析物的回收率。因为外源性分析物可能与内源性分析物的分子形式不同，其在基质存在或不存在的情况下可能不稳定，或者可能与内源性分析物有不一样的结合现象。
7.3.4 分解
对于靶向方法，分解过程旨在通过将蛋白质转化为更易被质谱（MS）检测的替代形式（即特征性肽段）以便于对蛋白质进行准确和精确的测量。从方法学角度来看，这种切割或水解最好是可预测和可重现的，以便能更容易的为产生的特征性肽段开发分析方法。许多不同的蛋白酶和化学物质都可以达到此目的，并且适合在临床环境中使用。然而，胰蛋白酶迄今为止是最常用的。
在为目标蛋白质定量建立分解程序时，开发者应考虑分解过程对测量准确度、精密度和实用性的影响。从这个角度来看，分解的关键性能特征包括：
• 效率（即回收率）
• 稳定性
• 可重复性
• 实用性
为了优化这些参数，开发者需要考虑许多变量，包括pH值；温度；化学添加剂；化学添加剂浓度；酶或试剂的浓度、化学计量学和试剂等级以及时间。此外，上游的变性和还原也可能影响分解的质量。不同分解化学物（例如酶）的最佳条件各不相同。值得注意的是，它们可能还因不同样本类型、同一样本中的不同蛋白质以及来自共同蛋白质分析物的不同特征性肽段而异。
理想情况下，分解过程应使用未修饰的天然样本或样本池进行优化。然而，在早期开发中可能需要向样本中添加外源蛋白质提高浓度，以便在同位素干扰和电离抑制存在的情况下以合理的置信度测量特征性肽段。在开发后期，通常比较校准物（在替代基质中添加外源性蛋白质的形式）与多个天然样本的分解情况，以识别校准物和蛋白质之间的潜在基质效应，这可能是误差的来源。
7.3.4.1 分解时间进程
为了优化蛋白质分解，方法开发者需要进行时间进程分析。即特征性肽段的回收率被绘制为分解时间的函数（见图11）。这样就可以在不同的实验条件下比较特征性肽段形成的重现性、速度、效率和稳定性（见图11a）。通过包括可切割的SIL内标（例如，SIL蛋白质或肽段），开发者可以同时评估相应SIL内标肽段的回收情况与未标记特征性肽段的回收情况以确定相对形成速率（见图11b至11f）。此外，将特征性肽段与内标肽段的比值绘制为分解时间函数可用于确定达到稳态的点（见图11g至11k），这个点表示最短分解时间。
未标记特征性肽段和SIL内标肽段的回收可能被绘制为它们的绝对测量响应（例如，峰面积）。然而，基质效应的差异（例如，电离抑制）可能会影响肽段丰度的解释。为了严格评估未标记特征性肽段和SIL内标肽段的回收情况，开发者可以在分解后的样本中添加第二种SIL肽段（即“SIL-2”）以标准化响应。然而，第二种SIL肽段必须被标记，以便质谱分析仪能够将其与未标记肽段和SIL内标肽段区分开来。在这个例子中未标记特征性肽段的标准化响应随分解时间的变化被绘制，同样地，SIL内标肽段随分解时间的回收率也被绘制。实际上，如果SIL-2的纯溶液与分解后添加SIL-2的样本同时分析，其相对应答可被用于评估分解样本的例子抑制或增强效应。
分解过程的时间进程分析通常至少要采集8个时间点。理想情况下，在分解过程的早期，当肽段仍在形成时，应至少采集3到4个时间点，以便准确评估形成速率。同样地，在形成停止后，理想情况下应至少采集4个时间点，以便准确评估降解速率（如果适用）以及准确确定特征性肽段与内标肽段比率达到稳态的点。如果在评估一系列广泛的分解条件（例如，在开发早期比较10种不同的变性条件），对每种分解条件采集8个或更多的时间点可能不切实际。然而，为了可靠地确定实验变量对形成速度、效率和稳定性的影响，每个分解条件至少采集和评估2到3个时间点，以避免单时间点分析推断出错误的最优条件。
时间进程分析可用于在不同的实验条件下评估特征性肽段的形成，以确定能够快速、高效且稳定形成特征性肽段的条件。同样，它们也可用于确定每个特征性肽段形成的最有利条件。一般来说，有利的条件会促使最快最高效的肽段形成，并保证分析物与内标响应比率的可重现性。此外，开发者需要比较患者样本、校准物和质控样本之间的分解动力学，以识别与分解相关的基质效应，这些效应可能会不同程度地影响分析物和内标，从而导致差的互通性。
缩写：IS，内标；SIL，稳定同位素标记。图11. 特征性肽段和SIL内标肽段的分解时间进程结果示例。Kp1是特征性肽段形成的速率常数。Kp2是内标肽段形成的速率常数。
7.3.4.2 分解变异性
如果分析物与内标比率在分解过程中未能达到稳态，分解过程是不具有重现性的，这可能是由于特征性肽段的持续形成（因为肽段形成缓慢）和/或降解（因为肽段形成后不稳定）。这两种现象都可以通过分解时间进程分析来识别。建议在实践中延长达到稳态的最短分解时间以减轻样本特定的基质效应，以及加热、样品均匀和/或混合，或者试剂添加等的变异性，所有这些因素都可能改变肽段形成的速度。
分解过程中特征性肽段的降解可能由许多因素引起，例如化学降解、酶促降解或吸附。不管具体原因是什么，通过分析分解时间进程数据，可以很容易地观察到肽段的降解。尽管特征性肽段可能存在时间依赖的不稳定性，但通常通过在分解前添加SIL内标，使其经历与特征性肽段相同的物理化学环境，就可以简单地实现稳态峰面积比值。在所有情况下，不稳定的肽段需要严格控制分解时间，以确保足够的回收率和分析灵敏度。
7.3.4.3 分解偏倚
在分解过程中，当特征性肽段在真实样本和外部校准物之间的回收率存在差异时就会产生系统误差。这种现象可能是由于基质效应，即从真实样本基质（例如，血清）中得到的蛋白质的特征性肽段的回收效率比从替代校准基质中的回收效率更高或更低。系统误差可能是由于不同基质之间特征性肽段形成和/或降解速率不同所致。因此，在方法开发期间分解时间进程分析至关重要，以确定分解过程在真实样本和外部校准物中何时达到稳态。蛋白质结合也可能影响某些特征性肽段的回收率。尽管使用了变性条件，但当蛋白质分析物在真实样本和外部校准物之间的结合不同时，也可能会出现基质效应。
加标回收研究可以识别由蛋白质结合或其他未解释现象导致的基质效应（见子章节6.7.2）。然而，这些研究的价值可能有限，因为添加材料（即蛋白质标准）在真实样本中可能不会经历与天然蛋白质相同的结合现象。此外，方法开发者应比较患者样本与校准物中内标的分解行为（例如，效率、动力学、稳定性），以区分影响分解的基质效应和由分析物差异引起的效应。
