导读

大家好，欢迎来到今天的质谱大讲堂。目前临床上基于液相色谱-串联四极杆质谱（亦称三重四极杆质谱）开展的检测项目主要有维生素D、新生儿筛查、脂溶性维生素ADEK、水溶性维生素、儿茶酚胺、类固醇激素、胆汁酸、TDM药物监测等。为了使业内各位老师能更全面的了解质谱技术，我们“临床质谱检测”公众平台自本期开始，将陆续推出“临床质谱大讲堂”系列专题，以飨读者。
本期内容主要介绍下SCIEX的串联四极杆质谱仪。我相信，质谱相关行业的老师和工程师们对SCIEX的仪器应该并不陌生。Sciex是首家推出商业化三重四极杆质谱仪的厂家，而且凭借着优越的仪器性能和质量在行业内拥有很高的知名度。

目前SCIEX公司有两款经国家食品药品监督管理总局（CFDA）认可，具备医疗器械注册证的仪器，分别为Triple Quad™ 4500MD和API 3200MD。这两款仪器都属于三重四极杆质谱仪，临床上主要用于生物样本中内源性或外源性有机化合物的精确定量分析。虽然Triple Quad™ 4500MD灵敏度高于API3200MD，但两者基本构造和原理类似，本文将从两款质谱硬件构造和工作原理上作一介绍。


1、液相色谱-串联四极杆质谱基本概念
液相色谱仪具有优越的分离功能，能将生物样品中不同化合物组分在色谱分离柱上进行分离，被分离的化合物组分按照先后顺序依次送入后端的检测器产生相应的检测信号。这里的检测器可以是紫外、荧光、示差折光、电化学检测器，也可以是质谱检测器。而质谱检测器又分为很多种，有机质谱中较长见的为四极杆质量分析器、离子阱质量分析器、飞行时间质量分析器等，其中四极杆质量分析器在临床上应用最为广泛。
 
串联四极杆质谱之所以又称为三重四极杆质谱仪，是因为其采用了三个串联在一起的四极杆质量分析器来识别和分离样品中的不同化合物。
 
液相色谱-串联四极杆质谱的工作方式为：
 
生物样品经液相色谱分离完成后，不同化合物会按照一定的顺序依次进入质谱离子源，然后在离子源中发生电离和雾化气化，形成气态离子。由于不同的化合物可以形成不同质荷比m/z的气态离子，而这些带电离子进入四极杆质量分析器后会在电场或磁场作用力下形成不同的运动轨迹。通过仪器参数设定，可以只让特定质荷比m/z的目标离子以稳定的运动轨迹顺利穿过四极杆并最终到达检测器产生信号，而非目标离子在运动的过程中会发生偏转从侧壁飞出，进而实现对样品中的目标化合物进行定性和定量分析。
2、SCIEX串联四极杆质谱基本构造图
下图为API 3200MD和Triple Quad™4500MD质谱的基本构造图（见图3和图4）。


整体上来讲，两款质谱构造上从左至右或从前至后依次为离子源、离子聚焦和传输器（Skimer/Qjet和Q0）、一级四极杆质量分析器（Q1）、线性加速碰撞室（Q2）、三级四极杆质量分析器（Q3）和检测器。从构造图上可以看出这两款质谱仪在结构上还是有些不同的。特别是碰撞裂解反应室，4500MD的线性碰撞室是弯曲的，而3200MD是直线型的。因此，从外观上来看，4500MD的体积要小于3200MD的体积。
3、SCIEX串联四极杆质谱各模块工作原理
1) 离子源

离子源是液相色谱和质谱质量分析器之间的桥梁，是使液体样品中的中性原子或分子电离，并从中引出离子束流的接口装置。因此，它的作是使待检测的目标物离子化和气化。根据电离方式的不同可将离子源分为3种：电喷雾电离（ESI）、大气压化学电离（APCI）和大气压光电离（APPI），其中临床上最为常用的为ESI离子源和APCI离子源。
我们都知道，离子在自然界当中是有正离子和负离子的，对应离子源的离子化方式就有正离子模式和负离子模式。下面我以正模式为例来介绍电喷雾电离和大气压化学电离。
电喷雾电离（Electrospray ionization，ESI）：
如图6所示，样品经液相分离并被引入离子源后，在高压电场的作用下形成带正电的液滴，然后被喷雾头两侧的辅助加热气不断高温加热（最高可达750℃）使其中的溶剂挥发，离子密度越来越大从而出现库伦爆炸现象，成为一个一个的带电离子进入质量分析器。

大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionization Atmospheric，APCI）：
也叫加热雾化（Heated Nebulizer），原理为液体样本通过液相到达离子源后，在一个加热管中被雾化，使样本很好的被分散蒸发，然后通过电晕针的放电过程使得样本带电，最后进入质量分析器（见图7）。
这里解释下样本的离子化过程：首先电晕针通过放电，使离子源内的N2或者O2带电，带电的N2和O2离子再把电荷转移到气态的溶剂分子上，最后再通过带电的溶剂分子将电荷转移到目标物分子上，由此实现目标物的带电过程（见图7）。
因此，与ESI不同，APCI不是通过在喷针和锥孔之间施加强电压来电离目标待测物，而是通过电晕放电使气溶胶中的溶剂分子和待测物离子化，然后将离子释放到气相中，随即使用质谱仪进行分析。

电喷雾电离ESI和大气压化学电离APCI对比：

SCIEX串联四极杆质谱ESI源和APCI源之间切换的时候很方便，只需更换喷头，然后调节电晕针的位置即可（图8所示）

2) 四极杆质量分析器
它是由四根精密加工的电极杆以及分别施加于X、Y方向的两组高压高频射频组成的电场分析器。高压高频信号提供了离子在分析器中运动的辅助能量，这一能量是具有选择性的，只有符合一定数学条件的离子才能够不被无限制的加速，从而安全的通过四极杆分析器。说白了就是挑选出符合我们设定好的质荷比的离子，也就是我们的目标物离子，然后进入下一级四极杆或者检测器，这样也就避免其他离子的干扰。
那单独的一个四极杆质量分析器是如何筛选目标物离子和去除干扰离子的呢？我们可以从下图中得到答案。

从图中可以看出目标物离子在其中的运动轨迹是做类似螺旋前进运动的。保证目标物离子稳定的运动轨迹的因素主要有四个：射频电压（Radio Frequency，RF）、过滤直流电压（Filtering DC，FDC）、轴向补偿电压（Rod Offset Voltage，ROF）、和真空环境。
射频电压（Radio Frequency, RF）：通过高频率的周期性的改变电压，从而让目标物离子能做稳定的圆周运动。
轴向补偿电压（Rod Offset Voltage, ROF）：通过一个较低的直流电压，为目标物离子提供一个轴向飞行前进的动力。
真空环境：真空环境确保了离子的运动不被干扰，从而顺利的到达检测器。
那不满足我们设定的质荷比的离子去哪了呢？这里就需要介绍下三重四极杆中的最后一个电场了——过滤直流电场。
过滤直流电场（Filtering DC，FDC）：此电场是加在两对电极杆上的特定直流电压（随RF改变方向），目的是选择离子，并帮助调整分辨率。进而可以过滤掉不符合条件的离子，其运动轨迹如下图所示。

由上图可看出，杂质离子由于电磁场的原因碰撞到四极杆，从而被剔除。离子通过与否主要与RF/DC的比值相关。
好了，介绍完单个四极杆中离子的运动轨迹，下面介绍下三个四极杆Q1、Q2、Q3串联起来后形成的工作方式和具体用途。实际操作过程中，我们可以通过设定Q1、Q2、Q3不同的工作模式，进而实现检测目的。
 
全扫描（Q1 Full scan） 
如图11所示，全扫描模式的原理是Q1扫描并放行特定质荷比m/z范围内的所有母离子，母离子可直接穿过Q2和Q3并到达信号检测器。该模式主要用于寻找母离子和未知化合物的定性。
选择离子监测（Selected Ion Monitoring，SIM）

如图12所示，选择离子监测模式时Q1扫描并只允许特定质荷比m/z的母离子通过，母离子可直接穿过Q2和Q3并到达信号检测器。该模式临床上使用较少，主要用于不容易碰撞裂解产生碎片的化合物的监测。
多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）

如图13所示，MRM多反应扫描模式采用以下方式进行工作：
Q1：筛选出特定质荷比m/z的母离子；
Q2：母离子进入Q2后与氮气分子碰撞，从而裂解成碎片子离子（多种质荷比m/z的碎片离子）；
Q3：碎片子离子进入Q3后经扫描并筛选出特定质荷比m/z的子离子碎片，只有该碎片才能通过Q3到达信号检测器。

由图14可知，MRM扫描原理是Q1扫描并放行特定质荷比m/z的母离子，到达Q2后和氮气惰性气体碰撞并裂解产生碎片离子，碎片离子进入Q3后被扫描并放行特定质荷比m/z的子离子。Q1和Q3起到过滤离子的功能，而Q2的主要作用是打碎目标物离子，形成子离子碎片。
该扫描模式筛选特定的母离子及其碎片子离子，可大大提高选择性，有效降低了假阳性率，是临床检测中最常用的工作模式。
子离子扫描（Product ion Scan，MS2）

原理是Q1扫描并放行特定质荷比的母离子，该母离子到达Q2后和氮气分子碰撞裂解产生子离子碎片，Q3扫描并放行给定质荷比范围内的所有子离子碎片。该模式主要用于判定质荷比已知的母离子在碰撞裂解后能产生哪些子离子碎片，可用于化合物结构解析和定性等。
母离子扫描（Precursor Ion Scan）

原理是Q1扫描并放行给定质荷比范围内的所有母离子，这些母离子到达Q2后经氮气碰撞裂解产生子离子碎片，Q3只选择扫描并放行特定的子离子。该模式主要用于子离子已知，母离子未知，寻找能产生该子离子的母离子。临床上使用串联质谱法开展新生儿遗传代谢病筛查时，可使用该模式来检测样本中的肉碱类化合物。
中性丢失扫描（Neutral Loss Scan）

原理是Q1扫描并放行给定质荷比范围内的所有母离子，这些母离子到达Q2后经氮气碰撞裂解产生子离子碎片，Q3只选择扫描并放行母离子与子离子有特定质量数差异的子离子，该模主要用于寻找能产生特定中性碎片的母离子。临床上使用串联质谱法开展新生儿遗传代谢病筛查时，可使用该模式来检测样本中的部分氨基酸类化合物。
 
常用的扫描模式就介绍这么多，为了方便大家理解与熟记，特整理如下表格：

3) Q2线性加速碰撞室
质谱同之所以能同时检测多个目标化合物（例如，串联质谱法新生儿遗传代谢病筛查时可以同时监测几十个甚至上百个氨基酸和肉毒碱化合物）的一个很重要原因就在于碰撞室的反应速度非常快，因此，这里就要介绍下SCIEX的线性加速碰撞室Q2了。
串联四极杆质谱工作的过程中并不是所有质荷比的母离子都能同时由Q1到达Q2，而是将不同质荷比的母离子按照一定的次序依次送入Q2碰撞室进行裂解反应（否则不同化合物母离子和其子离子可能无法归属关系）。因此，要分析的目标化合物越多，Q2碰撞裂解反应需要花费的时间就越长，对应的给定时间内每个目标化合物采集的数据就越少。
由此可见，决定质谱可以同时检测多少个化合物最主要的因素并不是Q1和Q3扫描速度的快慢，而是Q2线性加速碰撞室打碎一个母离子后，将子离子碎片运送到Q3，进而清空Q2碰撞室的速度。那SCIEX的线性加速碰撞室是如何设计的呢？

SCIEX线性加速碰撞室的出入口是有一个电势差的，离子在其中的加速由此实现。这也就很大程度的提高了质谱检测的效率。从3200MD到4500MD，SCIEX对线性加速碰撞室做了升级，3200MD的线性加速碰撞室是直线型的，而4500MD则是180度弯曲状（见图3，图4）。这样升级的好处不单单是质谱体积变小了，而且弯曲型的设计可以很好的过滤掉中性粒子，避免了不必要的干扰。
4) 检测器
质谱检测器有多种类型，SCIEX 3200MD和4500MD质谱的检测器属于脉冲计数检测器。其原理为离子流到达检测器后作用在电极上，产生电子流，电子流再转换成电压脉冲，离子离开检测器时的电压脉冲与进入该检测器的离子数量是成正比的。质谱仪可以监测这些电压脉冲，并将电压脉冲信息转换成具有特定m/z值的离子强度，也就是由软件显示成我们可以看到的峰信号强度信息（图19）。

小结
我们了解质谱的基本构造和工作原理知识后，在日常使用和操作仪器的过程中就更容易理解和熟记，当遇到故障或问题时也能更从容和理性的去分析和解决。希望大家能在以后的工作中一帆风顺、所向披靡！
好了，今天的临床质谱大讲堂就介绍这么多，期待与大家的下次见面！

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