2 规范性引用文件
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GA/T 122 毒物分析名词术语
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
GA/T 122中界定的术语和定义适用于本技术规范。
4 原理
生物检材经液液提取后，用液相色谱-串联质谱法进行检测。经与平行操作的空白样品和添加样品对照，以保留时间、质谱特征碎片离子峰和离子对相对丰度比进行定性分析；以峰面积为依据，采用外标法或内标法进行定量分析。
5 试剂、仪器和材料
5.1 试剂
本技术规范所用试剂除另有说明外均为分析纯，试验用水为一级水（见GB/T 6682规定），所用试剂：
a) 甲醇：HPLC 级；
b) 50%甲酸溶液：HPLC 级；
c) 乙腈：HPLC 级；
d) 乙酸铵：HPLC 级；
e) 氢氧化钠；
f) 乙酸乙酯；
g) 20mmol/L 乙酸铵溶液（含 0.1%甲酸和 5%乙腈）：称取乙酸铵 0.77g 置于 500mL 容量瓶中，加入适量水溶解，再加入 50%的甲酸溶液 1mL 和乙腈 25mL，以水定容至刻度 ，充分混匀即可；
h) 内标为士的宁或其它合适内标物；
i) 标准物质溶液：
1) 1.0mg/mL 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准储备溶液：分别取钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准物质（纯度：＞95%）10mg，精密称定，置 10mL 容量瓶中，加入适量甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成 1.0mg/mL 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准储备溶液。密封，置于冰箱中冷冻保存，保存时间 12 个月；
2) 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准工作溶液：试验中所用其它浓度的钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准工作溶液均1.0mg/mL 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准储备溶液用甲醇稀释得到，置于冰箱中冷藏保存，保存时间 3 个月；
j) 内标士的宁标准物质溶液：
1) 1.0mg/mL 士的宁标准储备溶液：精密称取士的宁标准物质 10mg 置于 10mL 容量瓶中，加入适量甲醇溶解并定容至刻度，配制成 1.0mg/mL 士的宁标准储备溶液。密封，置于冰箱中冷冻保存，保存时间 12 个月；
2) 2µg/mL 士的宁标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 士的宁标准储备溶液适量至容量瓶中，加入甲醇稀释，混匀，配制成 2µg/mL 士的宁标准工作溶液。密封，置于冰箱中冷藏保存，保存时间 3 个月。
5.2 仪器和材料
仪器和材料包括：
a) 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）
b) 电子分析天平：感量 0.1mg；
c) 涡旋振荡器；
d) 离心机；
e) 恒温水浴锅；
f) 移液器。
6 操作方法
6.1 定性分析
6.1.1 样品前处理
6.1.1.1 案件样品
6.1.1.1.1 血液、尿液样品
移取血液或尿液0.5mL，加入1%NaOH溶液50μL，涡旋混合1min，再加入乙酸乙酯3mL提取，涡旋2min后，以3000r/min离心3min。取上清液在55℃水浴空气流下吹干，残留物用混合溶液[甲醇:[20mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）(体积比7:3)]100μL复溶，混匀后，供仪器分析。
6.1.1.1.2 组织样品
称取剪碎组织0.5g，加入1%NaOH溶液800μL，涡旋混合1min，再加入乙酸乙酯3mL萃取，涡旋3min后，以3000r/min离心3min。取上清液在55℃水浴空气流下吹干，残留物用混合溶液[甲醇:[20mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）(体积比7:3)]200μL复溶，涡旋均匀后转移至1.5mL离心管中，于-20℃冰箱中放置30min，以13000r/min离心2min，取上清液，供仪器分析。
6.1.1.2 控制样品
取等量相同基质空白样品两份，一份作为空白样品，一份添加50ng/mL的钩吻素子、钩吻素甲和5ng/mL钩吻素己标准工作溶液10µL，作为添加样品，余下同6.1.1.1.1或6.1.1.1.2，与案件样品平行操作。
6.1.2 仪器检测
6.1.2.1 仪器条件
6.1.2.1.1 液相色谱条件
以下条件作为参考，可根据不同仪器实际情况进行调整：
a) 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（或其它等效柱），150mm2.1mm，5m
注：ZORBAX SB-C18柱为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本技术规范的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
b) 流动相：A:20mmol/L 乙酸铵溶液（含 0.1%甲酸和 5%乙腈），B:甲醇，流动相梯度洗脱程序见表 1；
c) 流速：200L/min；
d) 柱温：室温；
e) 进样量：10L。
6.1.2.1.2 质谱条件
以下条件作为参考，可根据不同仪器实际情况进行调整：
a) 离子源：电喷雾电离-正离子扫描（ESI+）；
b) 检测方式：多反应监测（MRM）；
c) 离子源电压(IS)：5500V；
d) 碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
e) 去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等电压值应优化至最佳灵敏度，参见附录 B。在以上色谱、质谱条件下，钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标士的宁的定性离子对、定量
离子对和保留时间见表 2，色谱图参见附录 C。
6.1.2.2 进样
分别吸取案件样品、空白样品和添加样品提取液，按6.1.2.1条件进样分析。
6.1.2.3 记录
记录各样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己可疑色谱峰的保留时间、离子对丰度比。
6.1.2.4 定性判断依据
以保留时间、质谱特征碎片离子峰和离子对相对丰度比作为定性判断依据。
如果案件样品中出现钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己两对定性离子对的特征色谱峰，保留时间与添加样品中相应标准物质的色谱峰保留时间比较，相对误差在2.5%以内，且定性离子对丰度比与浓度相近添加样品的离子对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，则可判断案件样品中存在该种目标物。
6.2 定量分析
本技术规范采用外标法或内标法定量分析。
6.2.1 样品前处理
移取（或称取）案件样品血液0.5mL（或尿液0.5mL，组织0.5g）两份，加2µg/mL士的宁标准工作溶液10µL（外标法可不用加），再加入1%NaOH溶液50µL（或800µL），余下同6.1.1.1.1（或6.1.1.1.2）。
另取相同基质空白样品若干份，添加适量钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己，制得系列浓度或单点浓度的添加样品，与案件样品平行操作。方法学有效性验证数据参见附录D。
案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的浓度应在工作曲线的线性范围内。配制单点浓度的添加样品时，案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己浓度需在该浓度的±50%内。
6.2.2 仪器检测
6.2.2.1 仪器条件
同6.1.2.1。
6.2.2.2 进样
分别将案件样品、系列浓度的添加样品或单点浓度添加样品，按6.1.2.1条件进样分析。
6.2.3 记录与计算
记录案件样品、系列浓度的添加样品或单点浓度添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己及内标物定量离子对的峰面积值，然后计算案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己含量。
6.2.3.1 外标法
6.2.3.1.1 外标-工作曲线法
在系列浓度的添加样品中，以钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己定量离子对的峰面积值（Y）为纵坐标、钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己含量（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。
根据案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值，按公式(1)计算出案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。
式中：
C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）或纳克每克（ng/g）；
Y——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值；
a ——线性方程的截距；
b ——线性方程的斜率。
6.2.3.1.2 外标-单点校正法
根据案件样品和添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值，按公式（2）计算出案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。
式中：
C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）或纳克每克（ng/g）；
A——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值；
A′——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值；
c——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）或纳克每克（ng/g）。
6.2.3.2 内标法
6.2.3.2.1 内标-工作曲线法
在系列浓度的添加样品中，以钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标定量离子对的峰面积比（Y）为纵坐标，钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己含量（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。
根据案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比，按公式(3)计算出案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。
式中：
C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）或纳克每克（ng/g）；
Y——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比；
a ——线性方程的截距；
b——线性方程的斜率。
6.2.3.2.2 内标-单点校正法
根据案件样品和添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比，按公式（4）计算出案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。
式中：
C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）或纳克每克（ng/g）；
A——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值；
A′——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值；
c——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）或纳克每克（ng/g）。
6.2.4 计算相对相差
案件样品按以上步骤平行测定两份，双样相对相差按公式(5)计算：
式中：
RD——相对相差（%）；
C1、C2 ——两份案件样品平行定量测定的结果，单位为纳克每毫升(ng/mL) 或纳克每克（ng/g）；
`C——两份案件样品平行定量测定结果的平均值(C1+C2)/2，单位为纳克每毫升(ng/mL) 或纳克每克(ng/g)。
7 分析结果评价
7.1 定性分析结果评价
7.1.1 阴性结果评价
如果案件样品中未检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己，添加样品中检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己，则阴性结果可靠；如果添加样品中未检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己，则阴性结果不可靠，应按6.1重新提取检验。
7.1.2 阳性结果评价
如果案件样品中检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己且空白样品无干扰，则阳性结果可靠；如果空白样品亦呈阳性，则阳性结果不可靠，应按6.1重新提取检验。
7.2 定量分析结果评价
两份案件样品的相对相差不超过20%（腐败检材不超过30%）时，结果按两份案件样品含量的平均值计算，否则需要重新测定。
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