蛋白质组学是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋自质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的学科。蛋白质组学包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明蛋白质组学及攻克提供理论根据和解决途径。蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。

目前，在方兴未艾的蛋白质组学研究中，质谱以其高灵敏度，高特异性等特点在蛋白质和多肽物质的定量分析中日益引起人们的重视，并已经成为蛋白定性鉴定的核心技术。

美国临床实验室标准化研究所于2021年发布了“CLSI C64 — 蛋白质和肽类的质谱定量”指南。CLSI C64为蛋白质和肽类的质谱定量提供了系统化、标准化的方法指南。

随着质谱技术在蛋白质组学中的应用日益广泛，国内对相关标准和指南的需求也日益迫切。为此，临床质谱网翻译了CLSI C64指南，希望能为国内实验室在质谱分析方面提供一些帮助，为行业的发展贡献微薄之力。

Citation
CLSI. Quantitative Measurement of Proteins and Peptides by Mass Spectrometry. 1st ed. CLSI guideline C64. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2021.

摘要

“CLSI C64——蛋白质和肽类的质谱定量”指南为临床蛋白质和肽类分析提供了从概念到验证的框架。该指南适用于那些熟悉传统小分子液相色谱质谱（LC-MS）而不熟悉蛋白质和肽类分析的人员。虽然蛋白质和肽类LC-MS分析与传统小分子LC-MS分析密切相关，但其涉及独特的挑战并需要复杂的工作流程，这些都在指南中进行了详细介绍。为了促进分析方法向临床应用的转化，该指南关注的是方法开发以及临床适用的分析验证。

委员会成员

第一章 引言

1.1 范围

这份指南为基于电喷雾液相色谱质谱（LC-MS）和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术开发和验证临床适用的蛋白质和肽类定量方法提供了综合性建议。C64实用性强，内容包括体液样本（如血清、唾液、尿液）中可溶蛋白质和肽类定量测定方法的工作流程概述以及实验策略。它涵盖复杂的分析，包括翻译后修饰（PTMs）蛋白质的测量。尽管存在多种离子化模式和相关的质谱仪器（例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间[MALDI-TOF]质谱），但此指南关注液相色谱（LC）和电喷雾电离（ESI）串联质谱（MS/MS）方法，因为该方法已被广泛使用且其实用性已被证明。

与临床诊断或临床结果相关的蛋白质或肽在体内可能以单个分子或一组相关的不同蛋白质形式存在。考虑到蛋白质的异质性和不同方法测定结果标准化的需求，合理定义被测量物是小分子分析和蛋白质分析之间的关键区别。为了设计合适的工作流程，方法开发者需要考虑分析物的性质、富集和分离策略以及仪器性能特征。随后，基于所选工作流程和明确定义的被测量物来选择校准物和内标（IS）。在方法开发初期，性能标准指导工作流程的构思和细化。在这个迭代过程之后，开发者最终建立出一个足够稳健以通过验证的候选方法。最后，进行严格的验证以证明其适合于常规的临床应用。

这份指南的目标用户包括医学、研究和公共卫生实验室；体外诊断仪器制造商；监管和认证机构。

组织和其他非体液样本的测定以及酶活性测定不在本指南的范围内。本指南也不包含蛋白质和肽序列线上分析软件工具和数据处理算法的详细讨论。

1.2 标准预防措施

由于通常不知道什么样本可能具有传染性，所有病人和实验室样本都被视为具有传染性，并按照“标准预防措施”进行处理。标准预防措施是结合“通用预防措施和体液隔离”实践的指导方针。标准预防措施涵盖了所有已知传染性病原体的传播，因此比通用预防措施更全面，后者仅适用于血源性病原体的传播。已发布的指南讨论了在人类和动物诊断医学中的日常操作，并且提倡实验室安全文化。关于防止经实验室仪器和材料传播的所有已知传染性病原体的特定预防措施以及对所有已知传染性疾病暴露管理的具体预防措施，请参考CLSI文件M29。

1.3 术语

CLSI作为标准化的全球领导者，一直坚定的致力于实现全球一致化。一致化是一种承认、理解和解释差异同时采取措施实现世界范围内统一的过程。CLSI认识到，全球计量界的医学公约在不同国家和地区有不同的演变，法律规定的术语使用、区域应用和不同共识的时间线都是一致化过程中需要重点考虑的因素。CLSI认识到自己在这些努力中的重要作用，共识过程侧重于术语的一致化，有利于促进标准和指南的全球化应用。表1旨在澄清以下术语的预期解释。

1.3.1 定义

准确度（accuracy）：测量值与真值之间的一致程度。
分析物（analyte）：在可测量数量的名称中代表的组分；注意：在化学中，“分析物”或物质/化合物的名称有时被用于表示“被测量（measurand）”。这种用法是错误的，因为这些术语并不指代量。
有证参考物质（certified reference material [CRM]）：通过计量学上有效的程序（用于一个或多个指定属性）表征的参考物质，并附有参考物质证书，其中提供了指定属性的数值、其相关的不确定性和计量溯源性声明。
带电状态（charge state）：离子的总电荷/基本电荷（e）。
（一个物质的）互通性（commutability）：指两种测量程序对给定物质测量结果的数学关系与它们在常规样本测量结果的数学关系之间的一致性。
（参考物质的）互通性（commutability）：参考物质的特性，通过两种给定的测量程序对该物质测量结果的数学关系与它们在其它给定物质测量结果的数学关系之间的一致性来证明。
消化（digestion）：将蛋白裂解成更小的片段（通常是肽段）的化学或酶解过程。
运行周期（duty cycle）：可以测量到信号的最小运行周期。
富集（Enrichment）：特定增加一个分析物浓度的过程。
提取离子色谱图（extracted ion chromatogram）：连续质谱采集过程中一段时间内一个或多个m/z值的信号强度图。
分离（fractionation）：将一个混合物中多种具有类似特征或性质的组分分开的过程。
碎裂(fragmentation)：前体离子解离成两个或多个产物离子。
In silico：在计算机上实施的生物实验或模拟。
内标（Internal standard [IS]）：以恒定量加入标准溶液或未知样本中以校正前处理过程中分析物的丢失或者分析中基质效应的化学物质。
离子比值（ion ratio）：两个m/z值的信号强度的比值。
离子通道比值（ion transition ratio）：一个母离子碎裂产生的两种子离子的强度比值。注意：该比值可以由色谱峰面积或最大色谱峰高的比值确定，也可以由单个质谱中的峰高计算。
同重元素（isobaric）：具有相同名义质量但不同精确质量的原子或分子的特性。
质量准确度（mass accuracy）：被测量离子的m/z测定值和以适当准确度和精密度进行测量获得的确切m/z值之间的一致性。
基质效应（matrix effect）：样本中除被测物含量水平之外可能影响测量值的所有其它特性。
被测量（measurand）：打算测量的量。
质荷比（m/z）：离子的质量与其所携带的电荷数量比值的缩写。注意：长期以来，它一直被称为“质荷比”，尽管根据目前公认的国际纯度与应用化学联合会的定义，m不是离子质量，z也不是电子电荷e-的倍数。
天然基质（native matrix)：经过标准采集过程后经历了最小预处理变化的基质。
平行性（parallelism）：通过稀释表明替代基质和天然基质的等效性。
肽（peptide）：由两个至50个氨基酸通过酰胺键连接而成的序列。
精密度（precision）：在指定条件下对相同或类似对象上进行重复测量所获得的测量数量值之间的一致程度。
前体离子（precursor ion）：可以反应形成特定产物离子或经历指定中性损失的离子。
产物离子（product ion）：由前体离子的反应或碎裂产生的离子。
蛋白质（protein）：由>50个氨基酸通过酰胺键连接而成，通常具有二级和三级结构特征的序列。
蛋白质形式（proteoform）：蛋白质的单一分子形式。
蛋白质形式（proteoforms）：蛋白质的所有分子形式。
蛋白酶解辅助（proteolysis-aided）：通过测量代理肽来确定蛋白质浓度；注意：代理肽是通过有意使用选定的蛋白酶或定义的化学消化步骤生成的。
蛋白水解肽（proteotypic peptide）：可以唯一标识蛋白质并可以通过串联质谱技术进行常规观测的肽。
定性离子（qualifying ion//qualifier）：一个特定m/z或通道，其与定量离子的响应关系已知。
定量离子（quantifying ion/quantifier）：用于定量的特定m/z或离子通道。
参考物质（reference material [RM]）：各种性质足够均匀且被开发用于校准测量系统、评估测量程序，或为其他物质赋值的材料或物质。注：用途可包括测量系统的校准、测量程序的评估、对其他材料赋值以及质量控制。
参考测量程序（reference measurement procedure [RMP]）：被接受作为评估其他测量程序测定值正确度，被用于校准或表征参考材料的测量程序。注1：在iso术语中，真实度与偏差、系统效应和系统误差有关，而“准确性”与真实度(及其关系)和精密度有关，精密度本身与标准差、随机效应和随机误差有关；注2：术语“参考测量程序”应理解为更高阶的测量程序；注3：对于同一种类的量，用于获得与测量标准无关的测量结果的RMP称为“主要参考测量程序”。
分辨率（resolution）：在质谱学中，传统上被定义为 m/z 除以 Δ(m/z)，其中 Δ(m/z) 是质谱中给定 m/z 值处的峰宽度。注：峰宽可通过几种非等效方法确定。通常的做法是在强度为最大峰高的一半处测量峰宽(最大峰高的一半处的全宽)。
响应因子（response factor）：检测器响应与被测量浓度之间的关系。
替代基质（surrogate matrix）：经过改造以常规使用的基质。注1：替代基质是用作生物材料的替代品，不具有天然基质的所有功能或组成特征（例如，人工基质、加标基质、稀释基质、剥离基质）；注2：替代基质可以是其他物种的真基质，而不是为该物种开发的测量系统（例如，在人类蛋白质测定中，使用马血清中的牛尿酸基质作为校定剂）。代理肽（surrogate peptide）：被选择用于代表特定蛋白质形式的肽段。
通道（transition）：一个前体离子m/z与其相应的产物离子m/z。
正确度（trueness）：无穷次重复测量结果的均值与参考量值之间的一致程度。
确认（validation）：当特定要求满足预期用途时进行的确认。例如，由制造商声明的用于验证测量程序是否适合在医学实验室环境中定量确定测量物的浓度的验证；注1：验证也可以定义为证明所使用的程序、过程、系统、设备或方法按预期工作并达到预期结果的行动(或过程)；注2：通过审查和提供客观证据，确认特定预期用途的特定要求能够持续得到满足；注3：验证是通过广泛的测试，建立和/或确认测量程序的分析和/或临床性能特征。注4：制造商的主要责任是确保满足商业开发的检测或设备的设计目标和性能声明，实验室的主要是为实验室自建方法负责。
验证（Verification）：提供客观证据表明给定的项目符合指定要求。例1：确认目标测量不确定度可以被转移;例2:使用制造商验证的检测方法获得的结果，没有任何偏差；注1：适用时，应考虑测量不确定度；注2：规定的要求可以是，例如，满足制造商的规范；注3：为C64的目的，验证定义为通过审查和提供客观证据确认规定的要求已得到满足；注4：对于实验室测量程序，验证是通过测试确认测量程序的性能特征与既定的标签声明相一致。验证通常由终端用户在该测量程序被用于实验室日常常规使用之前进行。

1.3.2 缩写

变异系数, coefficient of variation expressed as a percentage (% CV)
氨基酸分析,  amino acid analysis (AAA)
分析测量区间, analytical measuring interval (AMI)
载脂蛋白A1, apolipoprotein A-I (apo A-I)
认证参考物质, certified reference material (CRM)
脑脊液, cerebrospinal fluid (CSF)
脱氧核糖核苷酸, deoxyribonucleic acid (DNA)
乙二胺四乙酸, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
欧洲临床化学和检验医学联合会, European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM)
酶联免疫吸附法, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
电喷雾电离, electrospray ionization (ESI)
半高宽, full -width half maximum (FWHM)
糖化血红蛋白, glycated hemoglobin (Hb A1c)
高性能液相色谱, high-performance liquid chromatography (HPLC)
人血清白蛋白, human serum albumin (HSA)
国际临床化学联合会, International Federation of Clinical Chemistry (IFCC)
胰岛素样生长因子1, insulin-like growth factor 1 (IGF-1)
胰岛素样生长因子2, insulin-like growth factor 2 (IGF-2)
内标, internal standard(s) (IS)
液相色谱, liquid chromatography (LC)
液相色谱质谱, liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS)
液相色谱串联质谱, liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
测量范围下限, lower limit of the measuring interval (LLMI)
空白限, limit of blank (LoB)
检测限, limit of detection (LoD)
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- fight (MALDI -TOF)
质谱, mass spectrometry (MS)
串联质谱, tandem mass spectrometry (MS/MS)
氢离子浓度负对数, negative logarithm of hydrogen ion concentration (pH)
平行反应监测, parallel reaction monitoring (PRM)
翻译后修饰, post- translational modification (PTM)
质量保证, quality assurance (QA)
质量控制, quality control (QC)
三重四极杆, triple quadruple (QQQ)
参考物质, reference material (RM)
参考测量程序, reference measurement procedure (RMP)
国际单位制, International System of Units (IS)
稳定同位素标记, stable isotope–labeled (SIL)
稳定同位素标记氨基酸培养, stable-isotope labeling with amino acids in culture (SILAC)
选择反应监测, selected reaction monitoring (SRM)
总误差, total error (TE)
飞行时间, time-of- fight (TOF)
测量范围上限, upper limit of the measuring interval (ULMI)
紫外线, ultraviolet (UV)
世界卫生组织, World Health Organization (WHO)

未完待续……

注：本文由“临床质谱网”根据C64文件翻译并整理，未经许可，严禁转载。