CLSI C64：蛋白质和肽类的质谱定量-工作流程和仪器（翻译连载4）
发布日期：2024-11-05 来源：本站 浏览数：218 人
第四章：工作流程和仪器
本章包括
• 完整或蛋白质水解辅助分析的分析策略
• 基于分析物特性、期望的定量限和测量技术选择的工作流程
• 关于多电荷蛋白质及肽前体离子和经典小分子之间差异的细节内容
医学实验室通常采用基于抗体的方法，比如ELISA，放射免疫法，免疫比浊法来定量蛋白质和肽段，这些免疫方法比较经济且能实现高通量和自动化。然而其局限性越来越显著，质谱法已成为一种可行的替代选择，其独特的分析优势包括：
★ 以分子固有的特性（即m/z）来选择性定量特定蛋白质形式；
★ 开发周期相对较短，成本效益好且具有通用性；
★ 单次分析可测量多种蛋白质（即多通道）。
方法开发中充分发挥这些优势需要开发人员充分理解蛋白质和肽的生化特性、色谱行为以及各种仪器的性能特征，基于这些元素构建一个被校准的，稳健和被验证的方法。
4.1 工作流程
蛋白质和肽的定量分析通常使用两种不同的工作流程：“完整的”和“蛋白水解辅助的”，也被称为“自上而下（top down）”和“自下而上（bottom up）”。前者是完整蛋白质的定量，通常使用高分辨率的LC-MS。另一个则需要可控制的酶消化过程（或其它消化方式）将蛋白转化为代理肽段以便于使用LC-MS/MS检测（见图4）。
以上虽然定义了两种主要的工作流程，但根据蛋白质特性、仪器特性以及所需的性能（见表3）也可能会有差异。一些蛋白质比如IGF-1两种工作流程均可对其进行分析。同样地，一些完整蛋白质可以使用LC-MS/MS分析而无需蛋白质水解。此外，随着仪器性能和技术进步，新的工作流程也会被开发出来。
鉴于样本基质（通常是血液、血浆、血清、唾液或者尿液）的复杂性，多数方法需要分离或者富集步骤以增加分析物的丰度并清除干扰物质。图4中每个工作流程展示了单个的富集步骤，但实际上在蛋白水解前后可以进行多步富集。
图4 蛋白水解辅助和完整分析用于蛋白质和肽段定量的工作流程
表3 典型的工作流程特性
4.1.1 完整蛋白定量工作流程
完整蛋白质定量工作流程与小分子分析十分相似（见图4，橙色阴影）。完整形式的蛋白质分析无需消化过程和蛋白水解肽的识别，不必使用相关试剂和考量其品质。同时，没有同时测定多种肽的需求，这简化了性能特征和质谱的优化过程。
完整形式的质谱分析方法收集全扫描数据（即所有离子），产生所有蛋白组分和不同蛋白质形式的色谱峰。方法开发通常关注于所选的一个或多个蛋白质形式，定量信息来源于提取离子色谱图，当发现新的蛋白质形式时还可重新分析数据。比如，重新分析IGF-1的定量数据也辅助了IGF-2的定量和低频率的IGF-1蛋白质形式的识别。但是完整蛋白质的定量分析没有被广泛应用，相关文献也较少。
完整蛋白质定量方法的建立取决于多种因素，包括蛋白质量，稳定性，亚型复杂度，离子化效率以及期望的检测限（LoD）。通常，完整形式检测的工作流程更适合于小于30kDa且蛋白质形式多样性较少的蛋白质。质谱仪的分辨率和工作周期（duty cycle）需要与LC-MS谱图复杂度、选择性以及分析性能适配，这也限制了所能检测蛋白质形式的多样性。理想情况下，内标和校准物的结构要求是一致的，这个也是具有挑战性的问题（见第五章和第六章）。最后，医学实验室通常不像工业实验室一样配备有高分辨质谱，这些都限制了完整蛋白质定量工作流程方法的建立。但随着质谱仪性能的提升，实验室将能测量更复杂以及分子量更大的蛋白，这也可能会增加完整形式分析工作流程的应用。
4.1.2 蛋白水解辅助的工作流程
蛋白水解辅助的工作流程已被文献广泛报道并在医学实验室广泛采用（见图4，蓝色阴影）。这种工作流程与LC-MS/MS小分子定量密切相关，并且通常在医疗实验室广泛拥有的三重四级杆[QQQ]质谱仪上执行。尽管这种工作流程可能比直接分析方法更复杂，更难开发和实施，但它提供了更高的灵敏度，并扩展了可以可靠检测的蛋白质的质量范围。这些优势归因于离子化效率的提高以及离子电流在多个电荷状态和同位素间的分散减少。
在蛋白水解辅助的工作流程中，被测量的定义至关重要，因为定量的是代理肽段而不是蛋白质本身。通常，除非检测开发者仔细选择富有信息的代理肽段并开发出对不同蛋白形式不敏感的通用富集策略（见表3），否则会丢失大量的蛋白质形式信息。
图4展示了蛋白水解辅助工作流程的主要步骤。然而，细节的步骤还取决于蛋白质的特性和丰度。对于最高丰度的蛋白质，消化后处理步骤通常很简单即可分析代理肽段。对于更低丰度的蛋白质，高丰度的基质成分会干扰样品的处理和检测。在这些情况下，为了获得足够的灵敏度和选择性，需要进行消化前和/或消化后的富集。通常，所需的灵敏度越高，优化富集步骤的数量和效率就越重要。
与小分子LC-MS/MS不同，基于蛋白水解辅助的工作流程的LC-MS/MS分析需要使用能反映目标蛋白质在患者样本基质中消化动力学和定量特性的标准品和内标。尽管消化被认为是一个“终点”过程，但在实践中情况并非总是如此。蛋白质和肽段的生成和降解以复杂的方式相互竞争。接下来的第五和第七章将包括识别和解决这些挑战的指导。
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