您好,欢迎来到临床质谱网!
专家讲坛 | 袁超(第8期):干扰物
发布日期:2019-05-06   来源:临床质谱网   浏览数:163

编者导语:非常荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们会在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的精彩干货内容,以飨读者。本期袁老师为大家带来干扰物的精彩解读。

作者简介:现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。

第十节 干扰物

干扰物是临床检测的方法验证里必做的一项。但是干扰物对不同的科室来说,含义大不一样。如果说临床化学是一棵树的话,每一个科室,比如化学,免疫,还有质谱,只是这棵树上的一个分支。干扰物就像树上的鸟,分别站在每一个枝头。但是此鸟非彼鸟,化学方法里的干扰物在很多情况下是不会干扰免疫和质谱方法的。但因为历史的原因,每次验证质谱方法时都要把化学方法里的干扰物测一遍,而该测的干扰物往往漏掉了,在后来的工作中会造成麻烦。所以质谱法的干扰物测定要有特殊的程序。


化学光吸收法里的干扰物主要是溶血,脂血,和黄疸,因为这些物质都可能吸收、反射、或折射光波。免疫法里要测的干扰物应当包括各种自身抗体,人抗动物抗体、抗试剂抗体、生物素、交叉反应,等等能影响抗体抗原反应的物质。免疫法并不是一个直接的检测手段,要通过抗原抗体的结合来发生。而抗体抗原反应又比较复杂,容易被干扰。这也是大家普遍认为质谱法特异性更好的原因。在质谱检测里,被测物从上千种物质里逐步被分离出来,最后撞在光电倍增管里,产生一个电子信号,作为定性和定量的基础,其特异性是其它方法不可比拟的。但这不表示质谱法里就没有干扰物了。


在液质联用的方法里,能成为干扰物是一件很不容易的事情,必须和被测物是isocratic 和 isobaric。也就是说在色谱上和在质谱上都是分不开的。色谱的分离是基于疏水性,分子结构等理化性质。如果某种物质的理化性质和被测物相近,那就会和被测物一起从色谱柱里出来。如果这个物质不能被质谱检测到,那就只是会和被测物以及内标争抢离子,形成离子抑制。如果它正好和被测物的分子量相同,而碰撞断裂后有相同的离子片段,那就会被质谱检测到,成为“能看得见”的干扰物。


干扰物往往不会和被测物的保留时间完全一样,这样就形成了一个多余的峰肩,在主峰的前或后。干扰物的峰型有可能不对称,因为我们的色谱梯度不是针对干扰物来设计的。这种情况下就会形成拖尾。这样的峰与被测物的峰叠加在一起,形成不正常的峰型,很容易被看出来。不单单是被测物有干扰物,内标也会有干扰物。内标的干扰物往往会把内标的峰面积增加,很容易被看出来。在方法开发时,可以做一批不加内标的病人样品,看哪一个离子对比较干净,就选用哪一个。方法开发好上了临床以后会碰到很多意想不到的问题。一般一个新方法上临床一年以后没有问题才算可靠。季节性的药物,新药,新的抽血的管子,新的试剂,新的包装等等,这些都有可能含有干扰物。所以在方法开发和验证时可以多选用几个备用的离子对,一旦有干扰物,可以顶上。一般选2-4个。


说起离子对的选择,这里面的学问很多。大多数人是选丰度最高的那一个。我的经验是选丰度高的离子对不如选特异性好的。掉水,掉氨基,掉羧基,掉甲基、掉乙基的离子对特异性都不会好;碎片是苯环或苯环类似物的也不好;如果用延伸的话,要注意不要用延伸化试剂的离子。内标的片段最好也是选用特异性的片段。比如掉HDO的片段就比掉H2O的特异性高很多。实际情况不可能保证每个化合物都能找到2-4个可用的离子对。有时候只能退而求其次。甚至连【母离子-母离子】这样的离子对我也用过。这个化合物就像个硬核桃,你用锤子敲它,劲儿使小了砸不开;劲大了,砸碎了,一地渣渣,找不出一个可用的片段。我只好选用了一个比把它砸碎了的能量小一点的碰撞电压,希望这个电压能把可能有的干扰物砸碎,但我要的核桃还是完整的。另外一个比较奇特的例子是碰撞后的不稳定性。这个化合物在碰撞后可以丢A基团,也可以丢B基团,但两个的信号都不稳定。这时候我选用了两者之和,信号才算是稳定下来了。不稳定的情况还会发生在离子化这个阶段,尤其是溶液中的离子,比如盐,有可能附加在被测物之上,这样的话,会造成信号不稳。这个时候就要用一个小的电压去敲一下被测物,希望能把这个附带的离子敲下去。当然,这一步发生在进Q1之前,不同厂家对这个电压有不同的叫法。在这个环节还有一个气体,它的流动方向是跟离子运动的方向是相反的。我的经验是在不影响信号强度的情况下,把这个气的流速调的越大越好。因为反方向吹,可以把杂质吹走。这个气的使用和以前手工扬麦的原理相似:麦子落下时,风可以把瘪的麦粒和麦皮给吹走了,饱满的麦粒垂直落下来,被纯化、富集。所以这个风速要调到大的刚好吹不走麦粒,才能减少污染物,干扰物。建一个稳定的、干净的、污染物少的质谱方法有很多窍门。因为篇幅限制,我不可能一一列举,先讲到这里。关键是要对仪器的各种参数的了解、运用、思考、和试错。


不管事前准备的多充分,实际情况是出乎意料的复杂。干扰物的出现往往防不胜防。怎样去发现有干扰物呢?除了看得见的峰型的改变,还有两个指标。一个是离子对的比值,一个是保留时间。如果我们检测两个以上离子对,那他们之间的比值应该是相对固定的,如果偏高或偏低,那就是有干扰物了。偏高或偏低的界定在CLSI的法规里有。一般对低丰度的离子的要求相对较宽泛。所以在具体操作时可以在合乎规定的范围内做出对运营有利的选择。比如人为的加大碰撞电压,使定性的离子对的丰度降低,低到是定量的离子对的丰度的10%以下,这样就可以按照规定选用一个比较宽的范围。还有一些其它技巧,比如同一离子的多次使用,因为用文字解释起来比较复杂,我就不在这里介绍了。法规里一个值得改进的地方是对浓度低的要求应该宽泛一些,因为这时候信号和噪音的差别已经不大了,尤其是到了已经没有临床意义的低浓度时。另外,厂家的软件也有待改进,浓度低时,如果离子对比值超标,这样的峰就不要特殊的标出来了,直接给个小的定量就可以了;如果定的量在LOQ之下,就没有必要再去深究是不是有干扰物把离子对的比值搞乱了。离子对的比值按理是应该不变的,但是除了上述的浓度之外,还有其它因素。比如不同仪器,尤其是不同厂家的仪器之间;每次做完仪器维修之后;不同的流动相,等等,这些因素都会改变不同离子对之间的比值。有的厂家的软件设计的比较合理,是自动选用同一批次里的标准品的离子对比值来衡量病人样品。这样就会把其它干扰因素给去掉。


从保留时间也可以看出有没有干扰物。不是看绝对的保留时间,也不是看相对保留时间(相对保留时间是用在内标是类似物的情况下),而是看被测物和内标的保留时间的差值。氘标记的内标疏水性差,从反向柱出来的时间会稍早一点儿。如果是被测物先出来的话,就有可能混的有干扰物了。具体用什么范围来衡量要从实际中来。标准品和质控品干净,没有干扰物。把他们的时间差算个平均数,范围是正负2SD或3SD就可以了。注意要在计算时把软件里保留时间的小数点后面多放几位。保留时间的差值超出范围,甚至峰型都被改变了,也不见的就肯定有“看得见”的干扰物。有可能是“看不见”的干扰物捣的乱。这时,“看不见”的干扰物只抑制了被测峰的部分(前半部或后半部),所以才会把峰型搞乱,把保留时间挤的靠前或靠后,这时候可以用稀释法来检测(见上节)。最麻烦的是“看得见”和“看不见”的干扰物同时存在,使得结果很不可靠。这时候就只能说“因为有干扰物而出不了报告了”。另外干扰物有可能是上一个样品里的,因为色谱没有洗干净,杂质被带到了下一个样品里来了。把被干扰的样品重新上次一样就可以解决这个问题。有的杂质多的样品会干扰接下来的两个,甚至三个样品,或者直接就把色谱柱子给毁了。重复测一次,它又毁一根柱子。这种时候 ,我都想找客户倒赔我们钱。这种都是极端的例子,有些确实是因为病人在进行一项特殊的治疗,血液里有大量的特殊药物。如果这种毁柱子的情况经常出现的话,说明方法不够好,需要把样品弄的更干净些再进样。


如前所述,如果某个病人的内标的峰面积过大时,也可能是因为干扰物引起的。所以内标最好也要使用几个离子对。很多法则里对内标的离子对数目没有硬性规定。但是我个人感觉还是有至少两个比较好。


另外,还要把干扰物和污染物区别开。污染物就是被测的物质,但是不应该出现在样品里。它的产生原因五花八门。例如实验操作不规范,使用天平时没有清理干净,把后面的试剂、溶液给污染了;厂商在产品制造过程过程中无意中引进的污染;员工本身无意引进的污染(吸烟者的尼古丁,怀孕妇女超高的雌激素,等等)。这种情况下,空白和双空白可以看出来。另外每次从厂家收到内标以后,都要单独检测一下,看里面有没有不带标记的被测物。虽然软件里可以用数学的方法把内标里混进去的被测物去掉,但最好是拿到干净的内标为最好。


如果真的出现干扰物了,怎么办?首先是换一下离子对,看问题能不能解决。如果备用的离子对是好的,而且也被验证过,那报告是可以出的。如果发现大多数被干扰的样品都可以用备用的离子对解决,那可以考虑永久的换一下离子对。有时候自己实验室解决不了,可以把样品送到其他实验室,换一个方法说不定就不干扰了。


建质谱方法时,要测试可能成为干扰物的类似物。可以查文献看以前有哪些报道;可以查分子库,看有没有分子量相近的化合物。有的话,要拿来测一测。这个要比测溶血,脂血更有意义。


本节的总结:
1. 质谱法的干扰物有别于其他方法,只有色谱和质谱都分不开的物质才有可能成为干扰物。
2. 干扰物可以从峰型,保留时间,和离子丰度比值来鉴定出来。
3. 解决干扰物的问题要从建方法时开始,需要有大量的仪器操作和方法开发的经验。
4. 真是有解决不了的问题,只能老老实实的在报告里说明,不要把不可靠的结果上传。

我要留言
*登录后留言!   会员请登录,不是会员请注册
客服

QQ客服:3602981236 (在线咨询)


工作日 : 9:00-22:00 
节假日 : 9:00-18:00


微信客服:LC-MS-MS (添加咨询)


工作日 : 9:00-22:00

节假日 : 9:00-18:00

微信
公众号

扫码关注公众号,了解更多

实用工具
有奖投稿