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专家讲坛 | 袁超(第3期):妥协的艺术-权重
发布日期:2019-04-02   来源:临床质谱网   浏览数:310

编者导语:首先,非常荣幸的邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。为了答谢业内同行的厚爱,我们将会在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者。承接上期,本期袁老师为大家带来标准曲线中权重的精彩介绍。


作者简介:现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。



第五节 妥协的艺术-权重
理想的情况下,所有标准品的点都在一条直线上。但现实情况往往不会这么完美。就像要修一条高铁,靠近了这个城市,就可能疏远了那个城市。每个点都想高铁从我这里过。怎么取舍,怎样选择,这就是妥协的艺术。



既然不能满足所有人,那就把大家的不满足的总和做到最小就行了。对于标准曲线来说,这个方法就叫线性回归(linear regression,点到线的垂直距离)。实际生活中用的更多的是Deming Regression(点到线的直线距离)。如果你对X的测量很有信心,那就用前者;如果X和Y的测量都没有百分百的把握,就用后者。


目前为止,我们对每个点都是一视同仁的。好比公司食堂每周的菜谱,每个人都有投票权,这叫民主。但是公司业务上的决定就不能这样了。明年上马什么项目是不会过问保安和保洁的。这时候领导的意见就占上风了,所谓"位高权重"和"人微言轻"。在标准曲线上,这个还真翻译成了权重(weighing factor)。常见的权重是1/X。就好比投票的时候,你的票要乘以一个系数,这个系数可以是你的工资,也可以是你管理的人的数目。这样领导的权重就显出来了。反应在政治生活里,就是社会的精英阶层决定社会的走向。在临床检测中,这样做也是有意义的。比如你的曲线是从浓度1个单位到100个单位。那么1个单位的偏差对于1来说就是50%,但对于100来说就只有1%。所以划线的时候当然要照顾浓度低的点,上面的点偏个十个八个单位,也关系不大。1/X权重的意思就是每个点到线的距离要乘以1/X、再加和、然后取最小值。如果总统选举也可以加权重(选票乘以你过去四年交的联邦税),那些靠吃救济吃饭不交税的穷人就没有发言权了,民主党也就没戏了。所以政治是最能体现妥协的活动。参政两院的体制就是个典型。每个州有两名参议员的名额,众议员的人数则按你本州的人数多寡决定。一个加权,一个不加权。重大事项必须在参众两院都通过才行。这样既照顾了小州,又照顾了大州,这就是妥协。现在人人都有投票权,200年前黑奴是没有投票权。有一阵儿,一个黑人有3/5张选票。这也是南方州和北方州的妥协。因为如果不妥协,那就是战争。与其战争,还不如妥协。


另一个常见的权重就是1/X2。这样的话每张选票就不是乘以所得税了,而是乘以所得税的平方。这样富人就有更大的决定权了。在政治生活里,这个叫寡头,国家的命运决定在少数人手里。最极端的情况是由一个点来决定曲线的走向,这个叫独裁。1/X2权重反应在标准曲线上,就是低浓度的点更有决定性。这个在临床检测上是有意义的。大多数的指标都是低的是好,高的不健康。标准曲线的范围往往涵盖了正常人和病人的常见值。而正常人往往在这个范围的低端。临床检测最重要的是能把高的正常的值和低的病人的值分开,至于很高的值,测的准不准已经不重要了。好比空腹葡萄糖的100 mg/dL和125 mg/dL有很大区别,一个是正常、一个是糖尿病;但200和250就没有临床意义了。


1/X和1/X2,哪一个更好呢?这是一个困扰了我很久的问题。以前选1/X2是理所当然的,因为有专门的文章论述讲1/X2为什么更好。我也就从来没有试过1/X的权重。换了单位以后,发现标准曲线的权重基本上都是1/X。人越老,越没有志气。改造世界的勇气越来越小,改变自己适应环境的能力越来越强。单位这么大,牛人这么多,用1/X肯定有道理。收起自己的疑问,慢慢观察。发现除了权重,还有好多跟以前不一样的地方。这些不同渐渐开始发生了关联,变得有道理起来,最后帮助自己从不同的角度来认识这个行业,这个社会。
1/X2是建立在低浓度能测的很准的基础上了。你给了低浓度那么大的权重,如果测不准,那影响岂不是太大。怎样知道低浓度是不是测的准呢?答案要从实践中得来。把所有浓度的标准品测十次,算平均值和方差,再算CV。如果CV从高浓度到低浓度都在5%以内,那低浓度给个1/X2的权重是可以的。但如果高浓度的CV不错,但低浓度的CV接近10%了,那低浓度就不能给它1/X2的权重了。好比拍脑门一天一个主意的领导的话,不能太当回事。即便低浓度的CV在5%以内,我的建议还是用1/X。这个5%是在一天内取得的。如果不同的人在不同的日子里做,就不一定能达到了。如果真能达到,那你的方法就是好的过头了,需要把它人为的降一降,以节省成本。比如用的量变小一些,本来用200微升血样的,试试100微升;本来进样80微升的,试试40微升。进的样品量少,对仪器的污染就小,仪器使用的时间就更长;另外残留也会少,可以减少重复率。最终的目的都是降低成本。


低浓度的重复性差是允许的。CLSI里就有这样的论述。标准品的测得值和规定值之间的差别可以在低浓度时放开一些,别的点是15%,最低的点可以是20%。由于低浓度的点测的不是很稳定,所以不能给1/X2的权重,1/X是恰如其分的。为什么?有几个原因。1)医院是不会把整管血给公司的;它自己要留一些做其它检测项目。所以我们拿到的样品的体积要比医院小。不是每个样品都少。但是我们的方法要尽量照顾体积小的样品(又是权重),所以同样的检测方法,我们用的样品量要少。量少,这就会影响灵敏度,尤其是低端的灵敏度;2)公司的仪器更老,灵敏度更低。一般仪器的寿命是7年。医院财大气粗,买新仪器不眨眼睛。公司里超过10年的老仪器比比皆是。3)公司的标准曲线范围更宽,一般都到99%了。宽的好处是涵盖的范围大,超出这个范围的样品就会很少。所以公司用的标准曲线上的低浓度更低,高浓度更高。这可以减少样品的重复率(超出线性范围的样品,需要稀释后再测),最终目的是减少成本。总之一句话,公司里要用更差的仪器,更少的样品,把更低的浓度测出来。听起来好像很困难。但也不是做不到。具体的方法有很多,不是都能说的。1/X是能说的一个。用了1/X,我们就不倚重最低的点了,中浓度的点还是测的准,靠的住的。公司里样品量巨大,所以标准品可以用好几个浓度的。医院的量少。一天就20个样品,放上11个标准品就显得头大身子小了。一般都是5个点,所以每个点都重要。两点总是一条直线;三个点谁也说服不了另外两个;四个点可以两两作对;只有到了五个点,才能做到民主,协商,妥协,共赢。公司里每天成百上千的量,放11个点做曲线不在话下。在这11个点中,最被看重的是中间的7 个点。这七个点是中流砥柱。他们基本决定了标准曲线的走向。但凡有一个反骨,直接去掉就行了。这样画出来的曲线,延伸到低端也能保证是基本正确的。更何况公司的曲线低端已经低到没有临床意义了,放在那儿就是个摆设。最是摆设的应该是浓度为零的那个点。正常情况下是用不上的。如果它有读数了,那说明某种溶液被污染了。这个点好比总统的替身;他没事儿,就没他的事儿;他有事儿,那就是出大事儿了。


从上可以看出商业和医院实验室的区别。商业实验室是追求效率和效益的:在满足质量的前提下,怎么省钱怎么做;医院是直接服务临床的:精益求精,没有最好,只有更好,关键是让医生高兴。有时候好到过分的地步了。好比是跳高比赛,公司的目的是只要能过杆儿就行,再高就是浪费体力;医院是要做到比别人更高、更快、更强。如果50以下都是正常,公司就会觉得能把10和15区分开是就一种浪费。好比一个子弹打死一个敌人是好,三个子弹打死一个敌人就是浪费。我天天琢磨的就是怎么能一个子弹打死仨敌人。


说到权重,那就把另外几个跟标准曲线相关的参数也讨论一下吧。首先是过不过原点。一般情况下是不过的。过的话,低浓度点的偏差会太大。其中一个原因是本底。没有任何物质的浓度会绝对是零的。比如尼古丁,只要你的方法够灵敏,它是无处不在的。有了本底,标准曲线就无法过零点,强制过零点是会出麻烦的。


特殊情况下是可以过原点的,比如只有一个标准品的时候。这个标准品和原点连一条线就是标准曲线。这样做在质谱里非常少见,但在纯色谱方法里倒是很常见。我觉得原因有四。其一是色谱法多是很多年前建的老方法。那时候没这么多讲究,怎么简单怎么来。其二是老方法都很长,20-30分钟的很常见。这样的话标准品多了,样品做到下班也做不完,对服务临床不利。第三,光吸收做定量的线性非常好,不管是向下延伸还是向上延伸,因为它不像质谱,有离子化这么个不太有重复性的步骤。第四个就是色谱方法特有的,叫归零,这个在质谱上做不到。就好像打算盘,会的都是老人家,年轻人都不会。归零就是在检测方法的最开始强制的把那个时候的光吸收值定为零。这样的话,即便有本底,也都给归零、看不出了。目前为止,还没有哪一家的质谱生产商能做出自动归零的软件。一个标准品加上原点,那就没有权重什么事儿了,因为怎么画都是两点一线。自动归零延伸出另外一个更神奇的东西,那就是流动相可以循环使用!每天不用配流动相了。流动相从柱子流出去,经过光吸收的检测池,又流回到了装流动相的瓶子里!我第一次看到的时候简直不敢相信自己的眼睛,这个老古董的方法真的好有创意啊!因为有自动归零,所以流动相被污染了也可以用。另外,色谱法很多是等梯度洗脱的,只有一瓶流动相,所以可以重复使用,唯一不好的是方法的时间太长。第三,老方法的样品前处理很复杂,处理完的样品非常干净,不会有太大污染。现在的色谱仪更先进了,可以把出峰的那一段儿分到废液里,其它相对干净的还是流回到原瓶,这样样品就不用处理的那么干净,或者流动相重复使用的次数更多一些。


还有一个有意思的话题是标准曲线到底是直线还是曲线。顾名思义,应该是条曲线,可偏偏大部分情况下,它是条直线。有没有弯的标准曲线呢?有。


质谱的线性范围一般在3.5个数量级左右,也就是说最高和最低大概差个几千倍。这个在临床上够用了,很少有那个被测物在不同人的体内能差一万倍的。但是,凡事都有例外。一是人为的没经验,为了追求灵敏度,样品用的量太大,超出了质谱的线性范围,在高浓度的时候,浓度还在往上走,但是质谱仪的信号饱和了。电喷雾的时候,没有再多的离子可以给你了,浓度再高,信号也上不去了,这时候的标准曲线就要弯了,向下弯。还有更甚之的是连色谱都饱和了,出的峰不但高,而且头是平的,还有fronting。第二种情况比较特殊,是离子化的协同效应,也就是1加1要大于二。在被测物的浓度升高的时候,离子化有叠加的效应。这样浓度升高时,标准曲线也会弯,但是是反方向的弯,向上弯。还有一种解释是吸附作用。浓度低的时候,被测物被容器吸附了。浓度增高时,被吸附的相对减少,信号增加的比浓度更快,所以向上弯了。第三种情况是有多个被测物存在的情况下,为了照顾那个信号最低的,把信号高的被测物顶到质谱的线性范围以外了。这个时候的解决办法就是要人为的降一降那个信号好的,比如用个丰度低的离子,或者把Q2的碰撞能量加一加,等等。最终目的是让大家齐头并进,都控制在质谱的线性范围内,因为标准曲线还是直的好。

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