前文《样品前处理 | 质谱检测前处理技术之“SPE固相萃取篇”》大Q介绍了SPE固相萃取概念、分类及基本操作过程和原理的相关知识，错过的小伙伴可通过文末链接或在历史消息里看下。今天大Q想借助“临床质谱检测”公众号平台，接着前文的内容讲一下质谱应用中使用SPE固相萃取技术对生物样本进行前处理的方法开发基本过程和个人心得。
化合物基本理化性质：
我们接到新项目后，一定要先调查这个目标物的化学和物理性质，例如我们要了解它的稳定性、储存条件、LogP、溶解性等等，正所谓知己知彼才能披荆斩棘！清楚它的稳定性，我们就知道实验过程中的需要注意的地方，以免目标物分解；清楚它的溶解性，我们就知道用什么试剂去配制以及稀释；清楚它的LogP，我们就知道该选择什么类型的SPE。一般情况下LogP以3为界，大于3证明其非极性较强，小于3证明目标物有一定的极性。
注： LogP是有机化合物疏水常数的通用表达形式。LogP愈大意味着疏水性愈强，即极性越小，在反相色谱体系中，保留时间愈晚。可通过以下链接查找化合物LogP。
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/search.cgi
http://www.chemspider.com/
根据其极性大小，我们可按下面流程图对SPE进行选择。
选好固相萃取类型后，接着就可以设计前处理方案了。这里我们介绍一下临床质谱检测中常用的96孔高通量固相萃取仪并分步讲一下前处理步骤的设计思路：
固相萃取基本流程
01 活化
活化的目的有两个：一是让填料官能团舒展开；二是去除填料中自带的一些杂质。这个在之前的文章有详细介绍，这里就不在赘述。
一般情况是先用纯有机试剂进行活化，再用纯水相或者缓冲盐试剂进行平衡，第二步平衡要更接近于上样体系，以免影响填料对目标化合物的保留能力。这里的有机试剂一定要选整个方案中非极性最强的的试剂，目的确保非极性杂质尽可能去除干净，否则在最后的洗脱过程被洗脱下来，会干扰检测。
02 上样前处理
临床上生物样本以血液样本居多，但是血液本身粘度较大，一般情况下需要进行稀释，稀释比例大多为1:1。根据目标物的物理化学性质不同，可简单概括为以下处理方式：
1. 若目标物与蛋白有结合
可以选用一定浓度的磷酸溶液或者一定浓度的氢氧化钠的溶液稀释，磷酸溶液浓度一般在4%左右，氢氧化钠的浓度需要根据具体化合物进行验证试验进而确定。酸或碱稀释剂的选择要根据目标物的酸碱稳定性来进行选择。此外，还可以通过对蛋白进行水解或者蛋白沉淀来释放目标物。
2. 如果目标物为非极性或者强电离化合物
此时，可以选用缓冲盐或水对样品进行稀释。
3. 目标物为弱电离化合物，选择对应的强离子交换模式的SPE填料时
首先要查看目标物的PKa。若目标物为酸性，我们应该调节pH高于Pka两个单位或两个单位以上的溶液进行稀释，目的是使目标物完全电离，使其与SPE有更好的离子交换的能力。若目标物为碱性，我们应该调节pH低于Pka两个单位或两个单位以上的溶液进行稀释，目的同上。
4. 目标物为弱电离化合物，选择非极性交换模式的SPE填料时
我们同样需要知道目标物的Pka，选择的稀释溶液的pH要和离子交换模式相反，目的是尽量使目标物不电离，成分子态，以便更好的被非极性SPE填料更好的保留。若目标物为酸性，我们应该调节pH低于Pka两个单位或两个单位以上。若目标物为碱性，我们应该调节pH高于Pka两个单位或两个单位以上。
03上样
稀释后的样品就可以直接上样了。在过SPE的过程一定要严格控制流速。流速过快，会导致目标物来不及同SPE填料作用，进而无法有效保留在SPE上，导致目标物严重损失。
一般要选择强度适中的溶液，洗脱强度要大于上样液的强度，小于最后的洗脱液强度，目的是为了尽可能的除去上样过程中吸附在填料上的杂质，同时又不会导致目标物显著流失。
反向萃取体系，即非极性保留模式时：
一般洗脱方式为先水相，再用水相与有机相的混合溶液淋洗，可按5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇水或者乙腈水的混合比进行，根据结果建立淋洗曲线，找到目标化合物刚好被洗脱时的比例，淋洗试剂应选用有机试剂的含量稍低于目标物刚好被洗脱时的比例。
离子交换模式时：
淋洗试剂的选择可以是水相、纯有机相，也可以是水相有机相混合体系。但是两步淋洗要调节好pH。第一步淋洗液的pH最好接近上样液的pH，目的是确保目标物更好的保留在填料上；第二步淋洗液的洗脱强度要大于第一步，但要弱于洗脱液的强度，如果洗脱液为酸性可尝试用酸性淋洗试剂，目的是去除一些和目标物性质接近的杂质；如果洗脱液为碱性可尝试碱性淋洗试剂，道理同上。最终pH的选择同样需要做淋洗曲线，例如酸性淋洗试剂可按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的甲酸含量进行实验；碱性淋洗试剂可按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的氨水含量进行实验，过程同反相萃取淋洗试剂的选择。最后还需根据基质效应大小考虑更换淋洗液的种类，或者考虑增加第三步淋洗试剂。淋洗过程中流速可以稍快，但是要避免流出的试剂成“线”，推荐1s/滴以上。
05 洗脱
根据不同保留模式针对性的选择洗脱试剂。可选择淋洗曲线上能完全洗脱目标物的特定比例试剂作为洗脱溶液。洗脱完成后，还要考虑洗脱液溶剂体系同已经优化好的液相色谱条件中初始流动相是否一致，能否直接进LC-MS/MS分析，是否需要氮吹挥干后使用初始流动相复容（若不一致，可能会导致溶剂效应）。同时还要考虑是否需要通过氮吹挥干后使用更小体积的初始流动相复溶，以达到浓缩样品，提高上机浓度，得到更好的检测灵敏度的目的。
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