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样品前处理 | 临床质谱检测前处理技术之“固相萃取常见问题解析”终篇
发布日期:2018-11-22   来源:大Q 临床质谱网   浏览数:1092
导语
近年来,由于SPE出色的净化、富集以及分离能力,且操作简便、省时省力,得到了越来越广泛的应用。前几期给大家详细介绍过了固相萃取的填料分类、填料选取和方法开发步骤,本期主要给大家讲解下固相萃取常见问题的解析。


临床检测用96孔板的常见问题总结起来有4个:净化效果不理想、重现性差、回收率差以及操作过程中的流速过快或过慢。下面我们一一进行讲解。


Q1
                    净化效果不理想?

净化效果差的最常见的表现是基质效应过大,干扰检测,影响结果,有时还会伴随出现堵塞色谱柱、仪器和peek管。在介绍基质效应之前,我想先解释下后加标如何操作,因为基质效应的考察一般是用(后加标比上同等浓度的用流动相稀释的标准溶液-1)×100%。后加标的操作方法也很简单,只需用选好的空白基质进行该SPE方法的前处理过程,待完成后再加入一定浓度的标准溶液即可。计算出的数值如果大于40%或小于-40%,则认为基质效应过大。

基质效应过大分两种情况:

① 检测结果能达到临床要求的最低定量限(最小浓度达到十倍信噪比)。这种情况有两种解决办法,其一可以在色谱柱之前加上一个预柱,来去除一部分杂质,以防堵塞色谱柱和仪器。但前提是测得的基质效应的CV<15%;其二需要优化前处理的淋洗步骤或者调节洗脱液的强度。详见前期“SPE方法开发篇”。

② 如果检测结果不能达到理想的最低定量限的话,我们就只能优化前处理方案了,例如优化该方案的淋洗步骤或者改变洗脱液的强度,如若没有改善,就需要更换更合适的SPE小柱。详见前期“SPE方法开发篇”。

Q2
                        重现性差?

导致重现差的原因:

人为误差:有些前处理步骤操作繁琐,很容易会出现人为误差。这时我们就需要简化操作流程,制定详细的操作SOP。
 
基质效应:

有的时候样品太脏产生的基质干扰也会造成重现性差。改善方法为优化淋洗或洗脱步骤,再者更换合适的SPE小柱。

仪器不稳定:

在进行前处理方案开发之前,我们要保证质谱处于最佳状态,提前tune好最优参数。同理,我们也要考察液相的稳定性。

Q3
                        回收率差?

导致回收率差的原因:

目标物在SPE柱上未完全保留,上样或淋洗过程有损失。
验证方法为进行空白溶剂加标实验,收集上样液和淋洗液进样检测。若测得目标物的含量超过5%,则证明损失较大。

改善方法为:

如果是因为上样量过大或者浓度过高导致,我们需要减少上样量和或降低目标物浓度;如果是因为上样液和淋洗液的强度过大,我们需要降低其强度。
 
洗脱液强度较低:

验证方法为多做几个高洗脱强度的试剂进行对比。最后需选择最优的洗脱试剂。
 
基质效应
基质效应分为基质增强和基质抑制。验证方法为(后加标比上同等浓度的用流动相稀释的标准溶液-1)×100%,所得结果大于0,则为基质增强;所得结果小于0,则为基质抑制。
改善方法同“净化效果不理想”。
 
目标物与杂质有结合:

确定该问题需要我们在进行方法开发之前对目标物进行详细了解与调查,提前搞清楚会与目标物产生结合的杂质,然后根据结合的原理来设计方案,使目标物释放出来。

Q4
                   流速过快或过慢?

流速也是SPE操作过程中的一个非常重要的参数,流速的快慢会影响回收率及平行性,一般流速控制在3-5s/滴。一般情况下,如果SPE上下都使用孔径20μm以上的PE筛板是可以依靠重力让试剂自然滴落的,这种情况一般流速较均匀。但是有些SPE可能会有20μm以下的蛋白沉淀筛板,还有特殊的SPE板例如微孔SPE板(10mg以下填料量),这几种一般对试剂造成的阻力较大,使得我们不得不依靠正压或者负压操作。这就要求我们熟练的使用前处理设备,调节合适的气压使试剂流速均匀。如果出现无论如何增大前处理设备的气压,液体均难以流出SPE,则需要考虑以下几个方面:

样本粘度过大:

需要对样本进行适当稀释,如果为液体样本,推荐稀释比例1:1。
 
样本中杂质颗粒较多:

这种情况造成的堵塞在使用微孔板中最为常见,这也是目前市面上微孔板的一大问题。推荐在前处理操作之前对样本进行离心取上清操作。




今天大Q就介绍这么多,本文内容均为个人拙见,希望能与大家多多交流与学习!


原文供稿 | 大Q
      编辑校订 | Summer


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