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专家讲坛 | 袁超(第4期):同位素内标
发布日期:2019-04-04   来源:临床质谱网   浏览数:282

编者导语:首先,非常荣幸的邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。为了答谢业内同行的厚爱,我们将会在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者。承接上期,本期袁老师为大家带来同位素内标的精彩介绍。


者简介现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。


第六节 同位素内标

同位素内标是质谱方法独有的,没有别的临床检测方法用到同位素内标。比如光吸收和免疫的方法,都无法分辨出被检测物和同位素内标的区别,因为它们的理化性质太接近了。如果真的加进内标,那测出来的值肯定大大的偏高。只有质谱才能把同位素内标和要检测的物质分得开,虽然它们的差别只有几个道尔顿。


有一句古老的谚语叫"你不可能两次趟过同一条河流,因为你第二次过河的时候,河里的水已经跟上一次不一样了"。液相色谱也是一条河,先从溶液瓶流到色谱泵,压力增加后推着样品到色谱柱子,在柱子里实现色谱分离后,不要的分流到废液,有用的流向质谱,最后在spray里气化、离子化,钻进质谱。这中间就像弯弯曲曲的河道一样,充满了变数,同一个样品做多遍,每遍得到的最后结果,不管是色谱峰的峰高还是峰面积,可能会有很大差别。色谱只是一条河,样品的前期处理又是一条河。沉淀,离心,稀释,复溶都存在变数。怎样保证样品里被检测的物质在经过这一条一条的河以后,每次都以差不多的面目飞进质谱呢?内标是一个主要因素。


现在的内标基本都是稳定同位素标记的,最常见的是氘和碳十三。内标用在质谱上是上个世纪五六十年代的事儿,那时候这个新技术叫"同位素稀释法"。这个名字古老的就像"学部委员"一样,现在再没人使用了。把这个词挂在嘴边的都是些八九十的老头子。但那时候同位素内标可是个新鲜概念,人们借用了渔民的术语来描述它的用处。渔民们每年要估计湖里鱼的产量,然后根据产量来定捕捞量。怎样精确的定量湖里有多少鱼呢?这个就像怎样准确测量血液里的分子浓度,总不能跳进去,一条一条的数吧。如果把湖抽干,然后再数。可这与初衷事与愿违。所以渔民们发明了一个聪明的办法。他们先抓一千条鱼,每个鱼的背上做个记号,穿个小铁环,然后把这些做了记号的鱼再放回湖里。过几天,再捕一千条鱼,然后看这些鱼里面有多少条是有记号的。然后公式一算,就能估摸出湖里有多少条鱼,带标记的鱼越少,湖里的鱼越多。把有记号的鱼放回湖里,稀释到广大的没有记号的鱼群里,这就是"同位素稀释法"名字的由来。


同位素内标和被检测物是同一个物质,但是其中的几个氢原子被氘所取代,或者是碳十二换成了碳十三,理化性质基本不变。即便是背上多了个这么个"金属环","鱼"该怎么游还是怎么游,不管游过几条河,几道弯,始终能代表着没有标记的鱼。如果河拐弯儿时,丢了几条鱼,那有标记的也会丢几条,最终的比例是大致固定的。到了质谱检测的时候,有标记的没标记的分子会被分开来算。质谱就是一个能检测分子量的精细的秤,几个道尔顿的差别可以分得清清楚楚。标记了的鱼放一堆儿,没标记的一堆儿。然后算比例来决定浓度。如此这样,漂流时所经历的变数都被内标的此消彼消,此长彼长给扯平了。


所以内标要跟被检测的物质是同一条"鱼"。不能你要算鲫鱼,却放了背上有环儿的鲶鱼进去。鲶鱼在湖底里游,不可能代表鲫鱼的行为,测出的数值会有偏差。但有时候市场上没有带环的鲫鱼卖,只能用别的鱼,如此的方法就不是很牢靠。其中一个表象就是稀释时测不准。稀释两倍,浓度应该减半,可是用"鲶鱼"的方法浓度不一定是一半,可能多,可能少。这种方法用起来要小心,市场上有卖鲫鱼内标时赶快换。


同样是标记,碳十三就比氘要好。氘好比是一个大铁环,标记上以后游的还是跟别鱼有些许差别。过反相色谱柱时,出的峰总是要早一些,因为氘的亲水性比氢要强。但是氘要比碳十三便宜很多。它是核电站冷却水的副产品,或者说是废料里提出来的,稍加分离就纯化出氘来了。绝大多数氘做的内标性能是很好的。出问题的经常是一些疏水性比较差,保留时间比较短的物质。出峰的时候跟很多其它物质一起出来,些许的偏差就能引起浓度测不准。氘标记在分子结构上的何处也很有讲究。有些化学基团,比如羟基,可以和溶液里的氢发生"氢氘交换",鱼的环儿丢了,那肯定就测不准了。一个补救方式是把内标放在氘做的溶液里,这样能保证"环儿"在用以前不丢。加到样品里到上样的时间很短,氢氘交换还来不及发生。但最好是把氘放到分子结构里不容易被交换的地方,比如苯环上,这样用起来方便、省心。


如果氘是个大铁环,碳十三就是个小塑料环了,对鱼的改变可以忽略不计。但是代价是碳十三比较贵,还不一定每一种碳十三标记的鱼都有。但近几年碳十三的内标越来越多。用的人多了,产量大了,价格就下来了。再说质谱这么灵敏的方法,内标只用一点点,经常是买的一小瓶还没用完呢,已经到保质期了。用量大的客户往往可以影响供应商。所谓店大欺客,客大欺店。需求大了,就可以让店家定制需要的"鱼"。小店就只能买市面上有的鱼。又一个例子证明只有大规模才能玩质谱,要不然耗材的成本太高。


加几个同位素(环)合适呢?一个两个太少,会被未标记物的同位素峰所干扰。临床质谱测的物质一般都在一千个道尔顿以内,加一加二的同位素峰有个百分之一二,但加三的峰基本就看不见了。所以加三个同位素最好。氘加到六个会严重影响保留时间,强烈不建议。碳十三不改变疏水性,加上六七个也无所为。但加多了,价钱就上去 。


有了合适的同位素内标后,每个样品里要加多少呢?这里没有一个标准的答案。内标的浓度不能太高,太高费钱,还抑制没有标记的鱼;也不能太低,太低测出来的variation太大。我的经验是标准曲线最上端的三分之一,取个好配的整数。另外一个经验是取病人的浓度的中间值。把内标配到这个浓度。这个浓度不是内标本身的浓度,是加到样品里后稀释过后的浓度。当然也有例外,有些物质的浓度太低,内标也是那个浓度的话variation太大;或者因为内标断裂产生的碎片太弱,必须加的过量,才能达到和未标记物一样的峰强度。一般这个时候断裂的键正好在氘附近,可以丢氢,也可以丢氘。丢氘的当然特异性高,但是这样的碎片比较少,信号弱,需要加的量多一些。最终目标是内标的峰高和正常病人的检测物的峰高差不多。但实际工作中,内标的浓度有时要大得多。这种一般是被检测物浓度太低,多加些内标起保护作用。如果样品制备中有丢失(比如被器皿吸附走了),那丢失的大多是内标,被检测物丢的少。这时候的内标虽然比检测物的浓度高很多,但还没有高到在离子化时抑制别的分子的地步。


前面涉及了在质谱里碰撞后产生的碎片的选择。这是一个很值得讨论的话题。不是峰最高的碎片就是最好的。碎片的特异性高更重要。建方法的时候多开几个通道,包括三到四个碎片,看哪一碎片特异性最好。做一批不加内标的病人样品,看哪一个内标的碎片最干净,就选用哪一个。如果都不错,那就选一个跟未标记物碎片的化学结构式等同的碎片。最好是这个碎片上也还带的有内标,哪怕只有一个氘,也可和未标记物的碎片分离开。这样在质谱的collision cell里做碰撞时,因为碎片相同所产生的残余干扰可以消除。


内标要尽早的加,最好是加完病人样品立刻加。能不能先加内标,再加病人样品呢?没有说不行,但这样做总觉得怪怪的。有时内标还不能加太早,比如要做dialysis的样品,加的早会影响dialysis的平衡。内标的浓度上面有讨论。内标的体积最好在100微升以上。太小的体积加起来variation大。当然有例外。如果做蛋白沉淀前用了太多的水溶的内标,有机溶剂的体积会很大,操作起来不方便。如果可能的话,可以把内标直接加到有机溶剂里,这样加内标和沉淀这两步可以变做一步。加的体积大一些,也好操作,除非内标在有机溶剂里不溶或不稳定。


每一个病人的样品里加了同样的体积,同样的浓度的内标,但是最后检测出来的内标的峰却不尽一样。除了一条河无法过两次外,基质效应也是一个重要因素。后续会有专门章节说一说基质效应。



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