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专家讲坛 | 袁超(第7期):基质效应(完整版)
发布日期:2019-04-24   来源:临床质谱网   浏览数:330

编者导语:非常荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们会在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者。承接上期,本期袁老师为大家带来基质效应的精彩解读。


者简介:现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。


第九节 基质效应

上一节讲到离子抑制是由于病人的样品“脏”,其中的某些物质抑制了被测物和内标的离子化程度导致的质谱检测信号降低。注意,这里的“脏”和“抑制”都是一个相对的概念,是相对于标准品来说的。标准品一般是配置在相对“干净”的基质里的,杂质相对较少,对离子化的抑制相对不明显。所以我们加相同量的内标在标准品和病人样品里,标准品里的内标信号要高一些,病人样品里的内标信号要低一些。怎样选择配标准品的基质是另外一个话题,在本节末会提到。病人样品里的内标信号低并不等同于测得的结果低,因为被测物和内标的信号都被抑制了,而我们做定量用的是被测物和内标的比值,在分子和分母都降低相同程度的情况下,比值是不变的,算出来的浓度也是不变的。这种情况下,我们说有离子抑制,但是没有基质效应。这也是我们引入内标的初衷,用内标去模拟被测物的行为,在此消彼消,此长彼长中保证最后定量结果的准确。


我对基质效应的理解是:同样浓度的被测物放在病人的基质里跟放在标准品的基质里产生的定量结果是不一样的。基质效应在临床检测上是一个被普遍接受的概念,各个科室的人都知道。在质谱方法里,基质效应往往和离子抑制联系起来。离子抑制是质谱法独有的,别的实验室的人可能从来没听说过。离子抑制可以导致基质效应,离子抑制也可以不导致基质效应(如上面举的例子)。另外,其他的因素也可以导致基质效应。


我们先来看一看因为离子抑制导致的基质效应。如果病人样品里的脏东西对被测物和内标的抑制程度不一样,基质效应就会产生了。比如被测物被抑制了50%,而内标只被抑制了25%,他们的比值就会发生变化,导致结果出错。为什么被测物和内标会被抑制到不同程度呢?我还没有看到一个完全令人信服的确凿说法。这里给大家提供几个比较流行的解释。第一是内标不好。内标不是被测物的稳定同位素标记的,出峰时间不一样。那就会产生如下这种可能,“脏”东西只是抑制了被测物和内标的其中一个,另外一个没有被抑制,或者抑制的少,这样就会产生基质效应。第二种解释是,虽然用了同位素内标,但是氘标记的内标疏水性要差一些,出峰要早一些,还是有可能造成被测物和内标之间的不同程度的抑制。这个说法听上去似乎有理,但是真正用实验去检测的话,结果也不是那么让人信服(有文献佐证)。尤其是当用了碳13的内标时,还出现基质效应,那就更不好解释了,因为碳13的内标理论上应该是不改变保留时间的。


临床检测有很多谜团,质谱里的基质效应的成因就是一个。我们可以很清楚的看到基质效应(下面会有解释),但是我们就是不知道到底是什么产生了基质效应。以往的解释往往集中在离子化这一步,其实其它的步骤,比如样品制备这个环节,也可能产生基质效应。我还没有看到过相关的发表文章,只是从自己的经验里做一些推导和猜测。


内标是外源性的,它要被加到样品里。加到样品里以后要和样品里的物质产生各种理化关系。如果这种关系在标准品的基质里和在病人样品的基质里不同,而这种不同会在以后的步骤里产生对定量结果的影响,那么基质效应就能产生了。到底是什么样的理化关系会影响到定量呢?跟蛋白结合就是一个。病人的样品里有各种蛋白,内标加进去以后可以和某些蛋白结合。而标准品太干净,某些蛋白不存在,其它的蛋白和内标结合的不是很迅速,需要一些时间才能达到平衡。而被测物在标准品和在病人样品里都已经放了很久了,该结合的都已经结合了,该平衡的早已经平衡了。这时候,如果样品制备好了就上样,标准品里内标还没有来得及跟蛋白结合,游离态的多;病人样品里的内标瞬时就跟蛋白结合了,游离态的少。在样品前处理中,第一步往往是把大分子蛋白去掉。这时候如果内标是跟蛋白结合的,也会被一起去掉;如果是游离的,则会被保留。如此一来,内标在标准品和病人基质里跟蛋白结合的差别,就会导致定量的偏差。如果样品制备好以后放置一会儿,让游离态和结合态在每个样品里都达到最终的动态平衡,就不会有基质效应,测得的结果就是对的。我没有做过任何实验去验证这个说法,这些假设和推导都是在我的脑子里完成的。读者没有必要接受我的说法,我只是想提供一些思路,让大家不要专注于离子化这一个步骤去解释基质效应。


基质效应产生的原因就讨论到这里,下面我们来讨论检测基质的实验方法。文献上有很多方法,以前工作过的科研团队对这个课题下了大功夫研究。大家的意见从刚开始的盲目崇拜文献,到后来的各抒己见、各持己见,然后用数据说话,最后成文在实验室自己撰写的方法验证指导手册里。其中的主要观点和实验步骤发表在几篇不同的文章里。这里我简要谈一下。验证有没有基质效应要遵循以下几个原则:第一,自变量(x轴)一定要是不同的基质;因变量(y轴)一定要是被检测物质的浓度,或者是能代表浓度的【被测物和内标的峰面积比值】。离开了这个原则的实验,不管在文献里、在法规里有多推崇,我们看了只能是呵呵。第二个原则是可操作性。“不想当将军的士兵不是好士兵”。我想说的是“没打过枪的将军也不会是个好将军”。没有一点儿实际操作经验,光靠理论设计出来的实验,往往看上去很美好,但操作起来让人很抓狂。有的实验设计的纷繁复杂,恨不得一网打尽所有的要素,反而在实际操作中顾此失彼,丢了西瓜,也丢了芝麻,让人真想把写规则的人叫过来,给我们演示一遍。你能做出来了,我们再做。


埋怨的话就说到这儿。下面谈谈我们是怎么解决问题的。理论上很简单,为了证明没有基质效应,只要在不同的基质里加相同的被测物,看测得的浓度是否一致就可以了。但这样的实验说起来简单,做起来可不简单。标准品基质还好说,不同病人的基质就不好办了。每个病人的样品就一点儿,又不能把不同病人的样品混在一起,那怎样准确的加进去固定浓度的被测物?被测物不能加干粉,必须是溶液。溶液加多了会改变基质,溶液加少了,变数会增大。一个病人的样品就1-2个毫升,还要预留出来一些测本底。最多能加个几十微升的溶液。这么小的体积,准确的称量是个问题,而且这还大多数是有机溶剂。小体积的有机溶剂称量、转移,麻烦多多。蒸发是个问题,蒸发后产生的压力会把液体挤出去。用针筒没有蒸发,但是有其它问题:针筒是经过校准的吗?针筒洗不洗?怎么洗?如果这一步的变数太大,我们怎么知道其后测得的浓度的偏差是由于基质效应引起的,还是因为加样的变数引起的?
经过两年多的探讨和摸索,我们最后制定的解决方案是一个“混合实验”。原理是把一个标准品和一个病人样品按1:1混合。如果混合物的数值正好是在标准品和病人的正中间,那就没有基质效应,反之则有。正好是中间值不太可能,只要跟中间值的偏差在20%以内就可以。一次的混合实验是不够的,建议做十次:5个女性病人加上5个男性病人。这样做的好处是满足了前面我说的两个原则。x轴是不同的基质(标准品、病人、1:1的混合基质),y轴是被测物的浓度。实验设计的很简单,这就满足了第二个原则。把1毫升的标准品和1毫升的病人样品混合,这个操作起来不难,准确度也好。具体的实验步骤文献里有,我就不重复了。


前面讨论了基质效应的成因和检测。下面我们来看,如果有了基质效应,我们怎么把它去掉。


首先要确定内标是稳定同位素标记的,内标碎片应该和被测物的碎片一致的。如果内标已经很好,或没有更好的了,那下一步就是换标准品的基质。标准品基质的选择有几个注意事项。最重要的是commutability,要能和病人样品互换而不产生基质效应。检测方法是用上面的混合实验。一个一个的基质试,看哪个能通过就用哪个。另外,标准品的基质还不能有本底,这对内源性物质是个挑战。外源性物质,比如药物,做一个隐性病人的pool就可以拿来当标准品的基质了。这样的标准品基质保证commutability好,因为它就是病人的样品。内源性的物质就要考虑空白血清,牛血清蛋白溶液,生理盐水,有机溶剂,水(排名不分前后,只是从复杂到简单)来做标准品的基质了。只要能保证commutability,溶解性好,保质期长,容易配置和储存,我建议怎么简单怎么来,不一定非要用空白血清。能通过混合实验的基质也可以拿来稀释浓度超高的病人样品。因为没有基质效应,稀释后的结果是可信的。与标准品基质的选择不同,质控品的基质最好要跟病人样品相似,最好有一个质控就是病人样品的pool。这样即使有因为标准品跟病人样品的基质不同造成的定量的偏差(基质效应),病人pool做的质控能把这个偏差反映出来,不至于上传错误的病人结果。


最后的补救办法是优化样品的制备。可考虑的选项有:确保内标有充分的时间达到平衡态,改变pH值或有机溶液浓度,以求快速达到平衡态,复融在起始流动相里,进一步纯化样品等等。改变色谱和质谱的参数也能影响到基质效应。但这中间就需要大量的经验和试错了。这个只能从实际操作中得来。由于篇幅有限,我没法面面俱到,我下面只讲一个例子。


检测离子抑制有一个postcolumn infusion实验。在这个实验里,内标被infuse到柱后的流动相里。进的样是处理好了的没有加内标的病人样品。检测的是内标的信号。主要看内标的信号在出峰的时间有没有被抑制(相对于空白或标准品)。我的经验是不但要看绝对的抑制,还要看出峰的时候,内标是不是变化很大。变化大有两个含义。第一个含义是不同病人之间的变化大;第二个含义是同一个样品里,内标信号在出峰时候变化大(信号变化的坡度陡代表变化大)。如果病人之间差别巨大,或者出峰是在一个陡坡上的话,最好换一下洗脱梯度,流动相,色谱柱,以期达到让峰在一个相对信号平稳的时候出来,这样可以增加信号的稳定性,对减少基质效应也有帮助。


这一节内容就到此结束,最后总结一下讨论过知识点。
1. 基质效应可以发生在离子化这一步,也可能发在样品制备或其它的步骤。
2. 基质效应可以用一个简单的混合实验来验证。
3. 去掉基质效应的方法有三:换内标,换基质,换方法。



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